1928年9月3日，刚刚度假回来的弗莱明来到实验室，他发现在实验室窗口附近的一个葡萄球菌的培养基上有一块青色的发霉物质，而在霉菌周围的葡萄球菌似乎留下了一个死亡的半透明环。他拿来放大镜一看，确实有一些变化，再放到显微镜下看看呢？果然霉菌周围的葡萄球菌都死了。即使发现这个现象，也没让弗莱明惊奇到哪去。因为这种霉菌抑制细菌的现象早在很久以前就被大量的报道过，现在早就成了常识。而且在实验室这种现象早已见怪不怪了，如果说自己一周之中不遇到那么几次培养基被各种乱七八糟的杂菌污染，那才不正常呢！
况且他当时研究的也不是抗菌类物质，他正在研究白细胞是如何杀伤细菌的！这完全就跟自己的试验意图不相干，一般人都会把这些污染的东西扔掉。但是弗莱明没有。原因有很多，比如这个青霉菌的颜色很漂亮；比如细心的他还发现，虽然说霉菌抑制细菌的现象很常见，但是抑制像葡萄球菌这样的强致病性细菌的现象好像就不常见了，况且这已经不是什么简单的抑制了，而是直接就给它裂解了，这未免有点惨无人道了吧！抑制或者杀死就行了呗，结果还来个碎尸万段，这么一看是不是觉得青霉菌的手段有点太狠毒了点，这个霉菌的杀菌效力是不是有点超级强大呢？至于最后一个原因就是这种霉菌生长的确实有点奇特，伦敦的夏天这么热，它竟然可以发霉，实在是让人匪夷所思。既然这株霉菌来之不易，又疑点重重，弗莱明就当仁不让地好好的研究研究这个天赐的礼物吧！
正是这些地方吸引了弗莱明，让他觉得这个青霉菌确实是值得下功夫研究一番的，当然也不是什么大研究，就像玩玩具一样搞一点其它方面的兴趣试验，看看这个青霉菌到底有怎样的威力。
于是弗莱明就开始用这种霉菌的分泌物，放到别的细菌培养基上试了试，结果都和葡萄球菌一样出现了半透明环，也就是说这种物质对其它这些细菌也具有明显的杀菌作用。
越研究弗莱明越觉得有意思。
于是他试着将这种霉菌的分泌物提纯，但是这种分泌物还是很有意思的，或者说是很脆弱。用蒸馏的方法，一加热就没有疗效，用普通的化学试剂进行提纯，结果不是遇到溶剂就没了抗菌药性，就是最后的提纯还得用到加热蒸馏。弗莱明又不是什么化学家，所以提纯对他来说，实在是最最困难的事情了。
其实从当时的科技水平来看，世界上根本就不具备分离纯化青霉素的能力，所以在当时的科学局限下，弗莱明的发现没办法转变成大规模的动物实验，甚至是人体实验。他也就只能用很少量这种不纯的青霉素放在动物身上，又放在人体身上，搞搞最简单的试验，结果都显示具有微弱的疗效，但是一旦深入研究就受到青霉素量的限制，没办法接着进行了。所以总体来说他还是没办法证明它的疗效，虽然在实验室的培养基里能够说明其强大的杀菌作用，但这远远是不够的。他有些很失望，于是草草的将自己的这个发现发表到了一个低端的杂志上，并且在里面用一小段话提及到了自己对于青霉素的发现和预测其临床应用的巨大潜在价值。
不过弗莱明还做了一件很伟大的事，那就是将这株青霉菌株保存下来。你可不要以为这是一件很简单的事情，在当时要想将这种霉菌保存，不是说像现在放到冰箱里冻一冻或者放到液氮里就行的。那时哪里有那么先进的技术呢？所以要想保存菌株，就必须要定期的传代，也就是从一个培养基转移到另一个培养基，等到长到培养基没有什么营养的时候，再换一个生存的“土壤”，然后就这样坚持着，弗莱明相信这株青霉的特别，他觉得总有一天他会找到一种分离提纯这种霉菌分泌物的办法，到那时就能知道它到底对人类有没有什么大用处了。他这一等就是10年，不过可以说是一个并不漫长的十年，因为好多发现都要等更久，比如在教堂后面种豌豆的孟德尔，他的结果被承认时已经是35年后了，那时的孟德尔早就入土为安了。
就在这被耽误的10年里，磺胺抢尽了风头，从被发现到大量应用，最后再到其副作用的显现和药效的渐渐失灵，最终导致其走下了历史的舞台。而此时的时机似乎已经成熟，一种叫做青霉素的新药即将横空出世，去接替磺胺真正揭开人类抗生素时代的序幕。
其实还有一个小插曲。
为什么弗莱明能够敏锐的发现这种细微的与文献报道的拮抗作用的不同之处，并进行试探性的研究呢？我们总说机会是留给那些有准备的人的，可能的确如此吧。弗莱明就是这样一个有准备的人。弗莱明参加过第一次世界大战，当时他以中尉军衔参加了皇家军医部队，在赖特上校的领导下，到法国的布洛涅建立了一个战地研究实验室，参与研究并协助治疗协约国伤员的传染病。在救治伤员的过程中他见证过大量士兵的感染死亡，其景象在他的记忆里留下了不可磨灭的印痕。于是1919年退伍之后，他又回到了圣玛丽医院开始潜心研究抗菌药物，但是研究了好多年也没有结果。但是就在弗莱明刚刚调转研究方向的不久，他就发现了这个奇怪的现象，因为先前对于抗菌药物知识的积累，让他敏锐的发现了这回这种拮抗现象的与众不同。因此，这才发现了青霉素的作用并且成功的保存了它。
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