- SMART-seq2 是 SMART-seq的升级版本（增加：甜菜碱、锁定核苷酸，使cDNA产量加倍）。
- 无论SMART-seq还是SMART-seq2都只能对含有polyA尾巴的mRNA分析，因为oligo(dT)VN的设计只针对了含有polyA的序列。
1. 最初的SMART-seq
SMART-seq（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript）是由美国和瑞典科学家共同开发的一种单细胞转录组测序技术，其能够 检测mRNA的全长。这是一个具有里程碑意义的重要技术。实际上，能够从单细胞生成全长cDNA的测序方案并不多，Smart-seq就是其中之一。对于等位基因特异性表达、SNV检测或者剪接变体等深入研究来说，覆盖整个转录组是一件非常重要的事情。
1.1 筛选目标细胞
作为一种单细胞测序方案，常规的SMART-seq通量有限。通常使用 细胞分选 或者 显微切割 等方法获得单细胞，一次建库只能完成1个细胞的检测，多细胞建库操作较为复杂。
1.2 测序流程
（1）细胞裂解：分离获得单个细胞，并将单个细胞转移至低渗裂解缓冲溶液（裂解液中含有RNase抑制剂）中进行裂解，转录组释放于裂解液中。
（2）逆转录：加入MMLV逆转录酶、dNTP、oligo(dT)VN Primer、MgCl2等，对mRNAs进行反转录，获得cDNA第一条链，同时由于MMLVRT的末端转移酶活性会向cDNA的5’末端加上非模板化的胞嘧啶（C）残基。
关键技术：
- 莫洛尼鼠类白血病病毒逆转录酶（moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase，MMLVRT）：同时具有模板转换和末端转移酶的活性，其在转录到mRNA的5’端末端的时候，会在新合成的cDNA的3’末端，多出几个C碱基。
- 特殊的引物设计：引物序列（5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30)VN3’，V代表A、C或G，N代表A、T、C或G），两个末端核苷酸将引物锚定在poly(A)尾巴的开始处，这样就保证了逆转录的起始位置正好是mRNA的3’端的序列终止位置。
专门识别polyA尾巴
（3）第二链合成：引物2对所加的C碱基进行互补配对，然后引导MMLVRT再次发挥聚合作用，得到双链cDNA。
引物2：由一段通用序列及它的3’端是3个非脱氧的G碱基构成（RNA的G碱基），这个引物可以与新合成的cDNA的3’端的几个C碱基互补杂交
（4）PCR扩增：cDNA合成之后，进行12-18个循环的cDNA PCR扩增（100 pg的总RNA，需要15个循环，对于10 pg的总RNA，可以进行18个循环），将扩增的cDNA用于构建标准的Illumina测序文库。
2. 迭代的SMART-seq2
SMART-seq2是经SMART-seq改进的一种测序方法，也是目前最常用的单细胞转录组技术之一。
在第一代基础上，主要于逆转录步骤中增加了 甜菜碱 ; 第二链合成时增加了锁定核苷酸（LNA）：
（1）甜菜碱
甜菜碱（N，N，N三甲基甘氨酸）是一种高效的甲基供体。在反转录体系中加入甜菜碱，其能够增加转录所需酶（蛋白质）的热稳定性，并通过破坏DNA螺旋的稳定性降低碱基对DNA热融化转变的依赖性。此外，甜菜碱还可以使cDNA的形成更加完整。一些RNA有着例如发夹结构、环形结构等二级结构，影响逆转录酶与其结合，加入甜菜碱可解决这一问题，最终得到完整的cDNA文库。此外，在加入甜菜碱的同时增加Mg2+的浓度也可在一定程度上提高cDNA产量。（2）TSO引物序列
TSO引物序列（5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3’）：在5’端带有1个通用引物序列，而在3’末端，有两个核糖鸟苷（rG）和一个锁核苷酸（Locked Nucleic Acid，LNA）修饰的鸟苷（G），可以促进模板转换，进而扩增出完整的cDNA序列。
LNA（锁核酸技术） 该技术是Exiqon公司的核心技术
- 原理：通过在核糖上加入一个"2 '-O,4'-C-亚甲基"桥链，把糖环的空间构象锁定，提高核酸互补链结合的稳定性，进而提高链结合的特异性。
- 应用优势：
-- a. 提高与互补RNA或DNA结合的热稳定性：一般在引物/探针中每加入一个LNA，热稳定性就可以提高3~8℃。一条探针中加入多个LNA，可以大幅提高探针与目标区段结合的稳定性
-- b. 极大的提高探针结合的特异性：用LNA修饰的探针对目标链结合时，在LNA所在的位置，碱基正确配对的引物比碱基不正确配对的引物，退火温度差20℃以上；远高于未修饰的探针的10℃的退火温度差。
-- c. 耐核酸酶的水解：一定程度上耐核酸酶的水解
