【2017 PCP】CRISPR/Cas9编辑AtCLE肽家族的表型

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概括

     在拟南芥系统中，用CRISPR/Cas9，对所有的32个CLE 基因进行编辑敲除，clv3和cle40与之前已有的报道表型吻合，说明编辑的可行性，在cle44突变体中，观察到原形成层细胞减少的表型，并且在cle41 cle44双突中该表型具有加性效应。给出进化树和gRNA设计位置。

内容

1. CLE 在早期陆地植物的基因组中就已经存在
2. 拟南芥中鉴定出32个CLE 基因（2016年）
3. CLE前体包括N端分泌信号肽，中间可变区，C端功能区，在转录翻译结束后进入分泌通路，N端信号肽被切除，C端被蛋白酶水解后，生成成熟的CLE
4. CLV3抑制干细胞增殖，clv3干细胞增多，此处clv3角果短棒状，心皮数目增加
5. cle40根尖小柱细胞分化推迟，小柱干细胞增多
6. cle41在下胚轴中原形成层细胞减少，木质部增多
7. cle41 cle44对原形成层的抑制具有加性效应
8. 由于CLV3受到CLV-WUS的反馈调节，所以在clv3突变体中，尽管clv3突变，QRT-PCR检测CLV3的mRNA仍然是升高的【检测的是该缺陷型mRNA吧，不然完整的CLV3已经被编辑了么】。在cle41 cle44单突双突中，CLE41 CLE44的mRNA水平没有受到影响【这是想表达什么意思呢，是想说，基因被编辑之后，转录可能不会受到影响，仍然会转录出编辑后的mRNA，但是该mRNA在蛋白水平上的功能却无法实现。就是说对于CLE的编辑，用QRT-PCR检测，一般是没有差异的？】
9. 所有的cle单突没有发育缺陷
10. 方法：
    Cas9系统：Gene-targeting vectors were constructed based on the pDe-Cas9 systems pro-vided by Holger Puchta (Fauser et al. 2014)
    gRNA设计网址：. Gene-specific gRNA sequences were designed using tools at the CRISPRdirect website (https://crispr.dbcls.jp/) (Naito et al. 2015)

进化树、靶点设计

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文献原文
Plant Cell Physiol. 58(11): 1848–1856 (2017) doi:10.1093/pcp/pcx139, Advance Access publication on 25 September 2017