Science丨肠球菌肽聚糖可增强检查点抑制剂癌症免疫治疗效果
原创 珍奇 图灵基因 今天
收录于话题#前沿分子生物学机制
撰文：珍奇
IF=47.73
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本研究发现了活性肠球菌表达和分泌的NlpC/p60 肽聚糖水解酶 SagA 的直系同源物可产生免疫活性多肽；SagA 在非保护性粪肠球菌中的表达足以促进免疫治疗反应，其活性作用需要肽聚糖传感器 NOD2的参与；此外，SagA 工程益生菌或合成多肽也增强了抗 PD-L1 的抗肿瘤功效。
癌症免疫疗法的抗肿瘤功效可能与某些种类的肠道微生物组相关。然而，影响宿主对免疫疗法反应的许多分子机制仍然难以捉摸。2021年8月27日，洛克菲勒大学的Howard C. Hang团队于《Science》杂志上发表了一篇名为“Enterococcus peptidoglycan remodeling promotes checkpoint inhibitor cancer immunotherapy”的文章。这项研究证明了部分细菌属肠球菌可改善小鼠肿瘤模型中的检查点抑制剂免疫疗法，具有特殊肽聚糖重塑活性和基于多肽疗法的微生物群可能会增强癌症免疫疗法，有望用作下一代免疫治疗佐剂。
癌症免疫疗法利用患者的免疫系统来阻止肿瘤生长，并在各种实体瘤和血液肿瘤的临床治疗方面取得了成功。特别是针对 CTLA-4、PD-1 和PD-L1 等免疫检查点抑制剂蛋白的抗体已被批准用于治疗多种人类癌症。然而，患者对免疫检查点抑制剂的反应是不确定的，检查点是否能阻断成功取决于许多因素，包括恶性肿瘤的突变负荷、成功的肿瘤抗原呈递、淋巴细胞的募集和浸润以及肿瘤微环境中的信号提示。最近，肠道微生物群已成为与抗 CTLA4、抗PD-1 和抗PD-L1 癌症免疫疗法疗效相关的有效因素。微生物的抗肿瘤活性在共生、粪便移植或直接接种后的临床前小鼠模型中得到了概括，这些表明相关微生物是改善治疗反应的直接病原体。然而，目前人们对免疫调节微生物可能表现的分子机制知之甚少。最近的研究表明，肠球菌属物种可以触发免疫信号通路并调节感染、自身免疫和移植物抗宿主病。这些观察结果促使研究者进一步探究特定的肠球菌属物种和菌株是否可以改善对检查点抑制剂免疫疗法的反应。
为了评估特定的肠球菌及其作用机制，研究者使用了小鼠肿瘤模型及口服细菌。他们首先关注人类肠道微生物群中两种最常见的粪肠球菌：E. faecium (Efm) 和E.faecalis (Efs)，发现在没有治疗干预的情况下补充人类共生大肠杆菌菌株Com15 不会改变肿瘤生长。随后，他们选择了低抗PD-L1剂量方案，并在每个物种的多个菌株（包括人源分离株、参考型和多重耐药菌株）中比较了两种粪肠球菌的活性，以确定观察到的协同活性是特异于粪肠球菌Com15的结果。三种测试的E. faecium分离株均观察到对肿瘤生长的抑制，但经分析的E. faecalis菌株均未观察到相似结果。且数量相似的菌落形成单位（CFU）表明，粪肠球菌菌株的抗肿瘤活性不是由肠道细菌数量的差异所产生。
为了解释物种特异性差异，他们检查了免疫调节活性的可能来源。通过分析，他们鉴定了一组NlpC/p60水解酶，它们在所有活性肠球菌中都高度保守。这组相关酶包含来自粪肠球菌的肽聚糖水解酶分泌的抗原 A (SagA)，可提高宿主对肠道感染的免疫力。随后，为了直接检测肠球菌中SagA 直向同源物的表达，他们对每个物种的分泌蛋白和细胞相关蛋白部分进行了蛋白质印迹分析。使用针对屎肠球菌SagA 的抗血清，在E. faecium、E. durans、E. hirae 和E. mundtii的上清液级分中观察到强信号，表明这些物种高度表达分泌SagA 样蛋白。
为了确定这些SagA直向同源物是否有功能，他们在体外分析了纯化重组蛋白对肽聚糖的水解活性。来自 E. durans、E. hirae 和E. mundtii 的蛋白质显示出 D,L-内肽酶对类似于E.faecium SagA 的模型交联肽聚糖片段的活性，以产生多肽 GlcNAc-胞壁酰二肽(GMDP)。结果表明免疫治疗活性肠球菌具有相似的肽聚糖组成和重塑活性。随后，他们研究了SagA 是否足以增强抗PD-L1检查点抑制剂免疫疗法的疗效。sagA 是粪肠球菌中的必需基因，因此他们将无活性的亲本粪肠球菌OG1RF菌株与工程化的、表达SagA的粪肠球菌-sagA菌株进行了比较。粪肠球菌-sagA 的肽聚糖谱显示出与 D、L-内肽酶活性增加一致的变化，表明SagA 表达活跃。
与用亲本粪肠球菌菌株治疗的动物相比，用抗生素治疗然后口服补充粪肠球菌-sagA的动物在抗PD-L1治疗后显示B16-F10肿瘤生长显着降低。这种抗肿瘤活性与在添加了粪肠球菌的动物中观察到的表型相似。他们接下来研究了表达SagA 的细菌是否也能提高其他检查点抗体对不同癌细胞类型的疗效，而不是B16-F10 黑色素瘤的抗PD-L1 治疗。在抗生素预处理的肠球菌定植动物中建立皮下肿瘤，包括 MCA205 纤维肉瘤或MC38 结直肠癌细胞，然后分别用抗PD-1 或抗 CTLA-4 免疫疗法治疗。在这两种情况下，当动物与表达SagA 的肠球菌和检查点抑制剂共同治疗时，他们还观察到肿瘤生长显着下降。用粪肠球菌-sagA 定植的动物显示肿瘤内 CD45+ 白细胞和 CD3+ 淋巴细胞的绝对数量总体增加。肿瘤浸润CD3+淋巴细胞的组成显示CD8+T细胞比例增加，但CD4+FoxP3+调节性T细胞没有变化。肿瘤含有更多表达颗粒酶 B 的 CD8+ T 细胞，这是激活的细胞毒性 T 淋巴细胞的标志物。四聚体染色还显示OVA 特异性 CD8+ T 细胞数量显着增加，与增强的肿瘤抗原特异性免疫反应引发一致。
肠系膜淋巴结的细菌负荷与SagA表达无关，这表明在本研究中，SagA没有改善活细菌的屏障转运。然后，他们将注意力转向SagA的肽聚糖重塑和多肽（如 GMDP）的生成，并发现了一种多肽的关键模式识别受体 NOD2。因此，他们生产了在染色体上表达野生型、催化失活 (C443A) 或分泌缺陷 (DSS) SagA 的乳酸乳球菌菌株。所有三种构建体都有效地表达了 SagA，并且野生型和C443A突变体SagA构建体在分泌部分显示出更强的信号，正如预期的那样。表达无催化活性的 SagA(C443A) 的乳酸乳球菌无法重现抗肿瘤表型，表明SagA 的酶活性是阻止肿瘤生长所必需的。 SagA 分泌缺陷菌株(DSS) 减缓了肿瘤生长，这表明该菌株分泌的少量SagA 可能足以部分抑制肿瘤生长，或由于肠道细胞裂解，活性非分泌型SagA 可能会从乳酸乳球菌中逃逸。
接着，他们验证了SagA 酶产物（MDP）是否也能改善对检查点治疗的反应。结果表明，与阴性对照相比，接受活性 MDP-L,D 和抗PD-L1 给药的动物显示出显着的抗肿瘤作用。用活性 MDP-L,D 异构体处理的肿瘤显示肿瘤内 T 淋巴细胞的比例显着增加，给药后骨髓细胞群发生了显着变化，巨噬细胞簇都减少了，而以Cx3cr1 和Nr4a1 表达为特征的特定单核细胞群增加。
NOD2 信号转导通过 RIPK2 和 TAK1 激活转录因子NF-kB 和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) 磷酸化级联反应发生。因此，他们发现了涉及这些蛋白质的多个经典基因集的富集，特别是在单核细胞和巨噬细胞簇内，这些基因在经过多肽处理后发生了变化。NOD2 信号转导通过转录因子NF-kB 的激活和丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 磷酸化级联反应通过 RIPK2 和 TAK1 发生。因此，他们发现了涉及这些蛋白质的多个经典基因集的富集，特别是在单核细胞和巨噬细胞簇内，这些基因在经过多肽处理后发生了变化。作为对NF-kB 激活增加的进一步证实，他们发现NF-kB 靶转录物Il1b 和 Nlrp3在 MDP-L、D 样品中以及IL-1b 促炎基因组中在整个肿瘤内髓系中增加隔间。
综上，他们的数据表明具有独特NlpC/p60 肽聚糖水解酶活性的肠球菌可以产生 NOD2活性多肽并调节体内检查点阻断免疫疗法的功效。他们的发现证实了大量新出现的证据，即 MDP 及其类似物的 NOD2 刺激可以通过多种途径改变宿主免疫，包括直接激活巨噬细胞以清除肿瘤细胞、单核细胞的表观遗传重编程、传统1 型树突细胞的产生和树突细胞的启动以交叉呈递到 CD8+ T 细胞，这些都与训练免疫有关。因此，这意味着微生物产生或合成的可以激活肽聚糖模式识别受体的小分子或许可用作下一代免疫治疗佐剂。
教授介绍：
HowardC. Hang，美国洛克菲勒大学免疫学与微生物学教授，主要研究化学信号在感染和免疫中调节宿主微生物相互作用的分子机制。这些化学信号（代谢物）可能来自宿主代谢（内源性代谢物）或环境（饮食、微生物群、治疗），并且难以从机制上阐明。为了剖析控制宿主-微生物相互作用的机制，其实验室已经开发了化学方法来表征代谢物-蛋白质相互作用，并采用关键动物模型从特定微生物群中发现新的保护因子并阐明它们的作用机制。这些研究揭示了宿主免疫和微生物发病机制中不可预测的代谢物 - 蛋白质功能以及新的微生物群保护因素，为感染、炎症和免疫治疗提供了新的治疗线索和生物标志物。
参考文献：
EduardAnsaldo, Yasmine Belkaid, How microbiota improve immunotherapy, Science, 373,6558, (966-967), (2021).
