1、扩增
（PCR）
2、跑胶
（制备1%的琼脂糖凝胶，取产物5微升点样，电泳，照相）
图片见电脑D盘悦姐文件夹下
3、乙醇沉淀
（100微升体系：10微升3mol乙酸钠；80微升产物，10微升水，水加不加根据产物的量灵活变化）
加250微升无水乙醇，共350微升
12000rpm离心15分钟，弃上清，顺离后，吸取上清，干燥，加50微升水充分混匀溶解。
仪器测得片段浓度分别为189；132纳克/微升
4、酶切
（50微升体系：5微升10×Buffer，
片段1微克，根据测得的浓度即换算为7微升片段；对应双酶切KPN1、BAMH1各0.5微升，剩余用37微升水补足）
后置于37℃培养箱酶切
1、菌落PCR：
体系无异，模板有异。
模板制备：加30微升无菌水，牙签划取少量单克隆插入离心管，拔出牙签；后吸取1微升加入19微升的体系中，PCR。
2、热激：
过夜培养的连接产物3微升？放入30微升感受态细胞中，冰上静置30分钟；
42℃热激30s，随即冰上放置2分钟；
加无菌培养基900微升，37℃恒温摇床放置1h后取出，
6000rpm离心3分钟，弃上清，留100微升菌体，超净工作台重悬（移液枪操作），涂布培养基（先加小玻璃珠，后加菌体）。
37℃倒置过夜培养。
图片发自简书App
图片发自简书App
