1. Cre-loxp系统及其应用介绍

Cre-loxp系统源于P1噬菌体的高效重组系统。
Cre (Causes recombination; Cyclization recombinase)是38KD的位点特异性重组酶，属于λ Int酶超基因家族，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。
LoxP (locus of X(cross)-over in P1) 序列是34个碱基的一段DNA序列，是由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列(核心序列)同时也确定了LoxP的方向。

1.1 Cre介导的重组反应：

• 两个loxp位点方向相同：删除

• 两个loxp位点方向相反：倒转
• 两个两个loxp位点位于两条染色体上：易位

1.2 Cre-loxp系统删除作用

应用：条件性的敲除和条件性的表达

Cell Metab. 2013 Jul 2;18(1):9-20

需要两种小鼠：
flox小鼠 (flanking/flanked by LoxP，在需要敲除的目的基因两侧加入LoxP位点/在目的基因前面加上LoxP STOP LoxP序列)和Cre小鼠(前面往往有一个特异性的启动子，这个启动子可以是组织特异性的也可以是细胞类型特异性的)。
Cre在哪些组织/细胞中表达，就决定了目的基因在哪些组织中会被敲除/过表达。

在使用Cre-loxp系统介导组织特异性过表达的时候，通常是在Safe harbor位点敲入。
Safe harbor敲入：Rosa26, H11位点。这两个位点在基因组上的位置明确，把目的基因插到这两个位点上，它的染色质结构可以使得它在各个组织和细胞类型中有比较好的表达。

Cre-loxp系统删除作用的灵活应用：
插入的Gene可以是编码基因，非编码基因，shRNA，circRNA等。
STOP可以是polyA，编码基因等。

Nature. 2007 Nov 1;450(7166):56-62.

这也就是🌈彩虹鼠。因为是在DNA水平的遗传标记，DNA可以被传给子代细胞，所以被标记的细胞和子代细胞将永久性的携带这个基因。不管子代细胞是出现了分化还是扩增，都会携带有这个荧光，因此就可以帮助我们了解这个细胞的前世今生。

1.3 Cre-loxp系统倒转作用

Nature. 2007 Nov 1;450(7166):56-62.

1.4 Cre-loxp系统易位作用

模拟体内染色体易位

EMBO J. 2005 Sep 7;24(17):3136-46.

1.5 可诱导的Cre-loxp系统⚠️

这个系统主要是对Cre酶进行了改造，将Cre重组酶和ER LBD(雌激素受体的配体结合区estrogen receptor ligand binding domain)相融合，形成定位于胞浆中的融合蛋白（Cre-ER）。只有在雌激素诱导后，融合的 Cre 蛋白才会通过构象变化从锚定蛋白 HSP90上解离下来，进入细胞核，识别loxP 位点并发生重组。这样就通过控制雌激素的注射时间，可以实现对基因重组时间特异性的调控。
为了避免内源雌激素的干扰，在配体结合区做一个点突变（G521R）就可以使 Cre-ER 只响应外源的人工合成雌激素（比如：Tamoxifen、4-OHT）的诱导，命名为 Cre-ERT。而另一种LBD 突变体融合蛋白被证明对4-OHT 具有远高于Cre-ERT 的敏感性，这种突变体就是大名鼎鼎的Cre-ERT2。它带有人ER LBD 中的3 个点突变：C400V/M453A/L544A。

2. Cre小鼠使用过程中的问题

2.1 新的Cre品系需要做的四件事：

1) 了解小鼠来源，背景信息及发表的文章；
2) 建立基因型鉴定方法，确认小鼠正确；
3) 验证Cre在目标组织中的表达
4) 验证Cre的敲除效率

• 了解小鼠来源，背景信息及发表的文章
  Mouse Genome Informatics CrePortal：
  在Recombinase (cre)中可以查询目的组织中哪种Cre是表达的或输入启动子，查询对应的Cre。

• 建立基因型鉴定方法，确认小鼠正确

• 验证Cre在目标组织中的表达和针对目的基因的敲除效率

2.2 Cre品系的评价：

1. 重组效率；2) 表达特异性；3) 漏表达情况

• LoxP位点的重组效率
  受Cre酶表达量影响
  受基因位置，flox区域大小影响

• Cre非特异性表达
  用Reporter小鼠验证表达细胞组织类型
  要特别关注生殖系统的非特异性表达（如果Cre在生殖系统里有漏表达，很可能会把flox小鼠变成ko小鼠）

Trends Genet. 2018 May;34(5):333-340. Cre在生殖系统里有漏表达的检测方法

• 可以利用flox小鼠，产生一个全身敲除小鼠

• Cre所在染色体位置需关注
  避免和flox基因位于同一条染色体

• Cre作用的Mosaic情况
  在一些目的细胞中Cre没有发挥作用，或者表达
  可能是因为位点的影响等原因，转基因要进行多个founder筛选

• Cre通常不需要纯合子小鼠
  通常杂合子小鼠cre表达量已足够重组
  纯合子Cre插入位点不确定，可能导致非预期表型

• Cre小鼠可能有表型
  Cre”毒性“问题
  Cre影响内源基因表达

• CreER漏表达问题
  CreER高表达易导致 Cre活性泄漏，比如C57BL/6-CAG-CreERT2和B6.Cg-Tg/(UBC-cre/ERT2)1Ejb/J (008085)
  漏表达对于谱系示踪影响很大

• LoxP位点位置对目的基因表达的影响
  LoxP的插入应不影响基因的正常表达

设计原则：
· 敲除尽量靠前的导致移码的exon
· 如果移码突变不可行，考虑翘除关键结构域
· 避免对调控区域进行改造
· 避免影响剪切位点
· 尽量在大的intron里面进行设计操作

3. Cre工具鼠构建需要考虑的问题

1) Cre or CreER；2) Cre/CreER插入在什么位置；3) 采用何种连接策略

3.1 Cre or CreER

3.2 Cre/CreER插入在什么位置

通常有两种办法：插到ATG位置上或STOP位置上

3.3 采用何种连接策略

IRES or2A⚠️
被IRES or 2A隔开的基因共用一个启动子，但不形成融合蛋白。（像平常我们做过表达，给蛋白加Flag或者GFP标签，那种是形成了融合蛋白）
IRES是插入在终止密码子后面，并不影响前面这个基因的表达。2A是一个剪切带，连接两个基因。
参考：基因编辑重点元件IRES & 2A peptide

参考：
Cre小鼠的简介与应用
南模生物 谱系示踪