系列笔记基于达澈生物讲座视频，从中初步学习了解生信分析中常遇到的组学分析技术。
ChIP-seq和 CUT&Tag、CUT&RUN讲座视频笔记 - 简书
ATAC-seq讲座视频笔记 - 简书
CLIP、RIP-seq讲座视频笔记 - 简书
Ribo-seq讲座视频笔记 - 简书
RIC-seq讲座视频学习 - 简书
(eccDNA)circle-seq讲座视频学习 - 简书
1、背景
1.1、RNA的特征
简略介绍下RNA的相关知识，感兴趣可深入查阅教材、文献等
- RNA有着多种多样的功能，可在遗传编码、翻译、调控、基因表达等过程中发挥作用；通常由DNA经由转录生成。
- 其中，mRNA（信使RNA）为遗传讯息的传递者，它能够指导蛋白质的合成。
中心法则
- 因为mRNA有编码蛋白质的能力，它又被称为编码RNA。而其他没有编码蛋白质能力的RNA则被称为非编码RNA（ncRNA），主要包括tRNA与rRNA
- 相比DNA，RNA最大的区别有：单链，较短，由于存在互补序列通过折叠形成双链接构。
image from wiki
-
RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs) 对RNA功能具有重要作用，例如RNA运输、可变剪切，翻译等等；具体可以见wiki的介绍
image from wiki -
RNA修饰(RNA modification)是指对RNA核糖核酸化学结构的改变（通常是接了一些基团），可能会改变其功能或稳定性。
以下图m7G为例就是指在RNA鸟嘌呤(G)的第七位N上加上甲基的甲基化修饰
common RNA modification
1.2、CLIP、RIP-seq
-
CLIP、RIP-seq两种技术，我觉得就可以简单理解为RNA版本的ChIP-seq
encode - 即主要研究特定RNA binding protein（RBP）在RNA上的分布以及RNA特定修饰的情况。从而达到以下目的--
（1）验证RNA与靶蛋白的直接相互作用及精确的结合位点；
（2）在全基因组范围内鉴定RNA与RBP的相互作用网络；
（3）lncRNA/circleRNA功能机制研究以及miRNA靶标鉴定。
也可以检测出RNA间的相互作用（例如lncRNA与miRNA）
- 下面就简单了解下这两种技术。
2、Clip-seq
- ultraviolet cross-linking and immunoprecipitation 紫外交联，免疫沉淀（2003年）
- 特征之一就是使用紫外交联方式，RNA与附着的蛋白（RBP）以共价键形式绑在一起，用于研究RNA结合蛋白在体内与众多RNA靶标（片段）的结合模式。
实验步骤
参考下图
- 1~2：紫外照射，使RNA与蛋白之间形成共价结合；然后降解RNA非蛋白结合区域；
- 3：使用RBP对应的特异性抗体，捕捉目标蛋白RNA复合物
- 4~5：RNA两端修饰
- 6~9：富集、纯化、去蛋白，再修饰、纯化
- 10~11：反转录、加接头，PCR建库
- 12：测序
image from 达澈生物
clip with RNA modification
升级过程
自2003年提出clip方法以来，出现很多改进的版本
（1）iclip 2010年
- individual-nucleotide resolution UV cross-linking and immunoprecipitation；
能够以单碱基的分辨率，来展示RNA-蛋白互作的详细信息 - 关键技术在于中间的 cDNA环化
（2）eclip 2015年
- enhanced clip
相比clip-seq，RBPs靶标识别率提高了2-3倍 - 不同之处主要体现在RNA文库制备步骤
在免疫沉淀的磁珠上添加一个3'RNA接头用于和RNA片段交联；并且添加一个3'单链DNA接头用于反转录之后交联
（3）hiclip 2017年
- hybrid and individual-nucleotide resolution UV cross-linking and immunoprecipitation；
在全转录组水平上鉴定与RBP结合的特定RNA复合体的方法 - 特征之一：若rbp同时结合两个rna链，均可以捕获出来；
通过连接酶将双链RNA的两端壁进行连接
2、RIP-seq
- RNA immunoprecipitation sequencing
- 通过免疫沉淀目标蛋白来捕获蛋白体内结合的RNA（基本类似chip-seq）
- 即主要利用能够特异识别某一RBP或者某一RNA修饰的抗体；
实验步骤（以m6A-MeRIP-seq为例）
参考下图
- 首先提取total RNA，将RNA片段化（100nt左右）
- 使用带有m6A抗体的免疫磁珠对发生m6A甲基化修饰的RNA片段进行富集；
- 然后纯化富集到的RNA片段；
- 最后上机测序。
image from wiki
RIP with RBPs
关于RIP与clip-seq的比较
image.png
3、数据分析
- 基本流程分析还是类似于chip-seq；
- 数据质控→ 找peak → peak 分析；
- 新的研究思路还是需要阅读相关文献。
image from 达澈生物
image from 达澈生物
最后推荐一个研究RNA结构的必备网站：ENCORI，里面有很多公共clip-seq数据等
