师姐我想请问一下，嘌呤霉素筛选多久后做t7酶切啊，我每次都是筛选两天消化下来然后提dna，跑pcr酶切。三次了设计了7个sgrna没一次有任何一个被切开，是不是筛选后还要配养一段时间等cas9发挥作用啊
CRISPR-Cas9基因编辑5--不可或缺的sgRNA活性预实验前言： 大家都知道CRISPR-Cas9有脱靶效应，并且每个sgRNA的效率都不一样的，因此在做正式实验之前，我们要验证sgRNA的效率，之后优中选优。还是那句话，同样的目的...
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好的，谢谢春卷姐
CRISPR-Cas9基因编辑3--sgRNA-Cas9质粒构建
简介和前期文章 我对之前的所有教程进行了再次详细的总结CRISPR-Cas9基因编辑之背景介绍及gRNA设计（上）[https://www.jianshu.com/p/e5c...
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我没有T4 PNK，第一步加T4 连接酶是不是也行
CRISPR-Cas9基因编辑3--sgRNA-Cas9质粒构建
简介和前期文章 我对之前的所有教程进行了再次详细的总结CRISPR-Cas9基因编辑之背景介绍及gRNA设计（上）[https://www.jianshu.com/p/e5c...
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春卷师姐新年好，我用你的方法做了好几次。质粒用的是新买的PX458和PX459,用的酶是NEB的BbsI-HF的快酶，感受态细胞用了Stbi3和DH5α都用过了，每次长得菌都不少，但是一次挑10几个单克隆，设计引物测序都只能测出空载。不知道为什么sgRNA老是挂不上去呢，是不是BbsI-HF没加rCutSmart。或者是我第一步有点不一样，我们PCR仪没办法每分钟下降5℃，我最慢只能每分钟下降6℃，是不是这个原因导致的呢。
CRISPR-Cas9基因编辑3--sgRNA-Cas9质粒构建
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