在基因差异表达分析中，我们的目标是识别在不同条件下表现出显著表达变化的基因。这些基因可能是响应特定处理、疾病状态或环境变化的重要标志，其表达差异对于理解生物学过程至关重要。
1、筛选差异表达基因时，通常使用两个关键指标：log2FC和padj。
1）log2FC（log2 倍数变化）衡量基因表达变化的幅度和方向。例如，log2FC > 0 表示表达上调，log2FC < 0 表示表达下调，绝对值越大变化越显著。
2）padj（校正后的 p 值）是显著性指标，经过多重检验校正，能够有效减少假阳性结果，提高筛选可靠性。
2、p 值筛选差异基因的局限性
p 值用于判断基因表达差异的显著性。若 p 值较小（如 < 0.05），表示该差异可能非随机。但在 RNA-seq 分析中，由于同时检验的基因数目庞大（常达上万），假阳性结果难以避免。例如，在 10,000 个基因中，即使显著性水平设为 0.05，也可能有 500 个假阳性。因此，单靠 p 值不足以确保结果的可靠性。
3、padj 的作用
为了控制假阳性率，引入padj值（校正 p 值），基于 Benjamini-Hochberg 方法控制假发现率（FDR）。设定 padj 阈值（如 < 0.05）可以确保假阳性比例不超过 5%。在实际分析中，padj 的使用显著提高了筛选结果的可靠性。（在DESeq2中，padj 值是自动计算的。）
4、计算 padj 的主要步骤：
1）对所有基因的 p 值排序，分配排名。
2）按排名计算校正因子：校正因子 = i / m × α（其中 i 为排名，m 为基因总数，α 为显著性水平）。
3）用校正因子计算 padj 值，并调整为单调递增。
4）保证单调递增：为了保证 padj 值的顺序合理性，Benjamini-Hochberg 方法还会调整 padj 值，使其在数值上从小到大递增。
5、log2FC 的意义
1）log2FC表示处理组相对于对照组的表达变化：
① log2FC > 0：基因表达上调。
② log2FC < 0：基因表达下调。
③ 绝对值越大，变化幅度越显著。
例如，处理组表达量为对照组的 4 倍，则 log2FC = 2；若表达量为对照组的一半，则 log2FC = -1。
6、综合筛选标准
1）差异表达基因通常基于以下标准筛选：
① padj < 0.05：确保显著性。
② |log2FC| > 1：保证变化幅度显著。
生物信息学领域非常广泛，难以一次说尽。我们下次继续更新，一起深入学习生物信息学的内容！
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