大家好，今天要和大家分享的是2021年9月发表的一篇文章：“Characterization of Molecular Heterogeneity Associated With Tumor Microenvironment in Clear Cell Renal Cell Carcinoma to Aid Immunotherapy”。
在这项研究中，作者分别基于TCGA和ArrayExpress（E-MTAB-1980）数据库中的免疫相关基因表达数据分析透明细胞肾细胞癌（ccRCC）的免疫相关亚型，并确定了2种具有不同免疫微环境特征和免疫治疗反应的亚型（C1和C2）。此外，作者还通过CMap数据库在2种亚型之间确定了用于治疗ccRCC的潜在小分子化合物。最后，作者构建了一个免疫相关（IR）评分系统并进行验证。结果表明，C1亚型中免疫评分、基质评分、TMB、TIDE和免疫检查点基因表达水平更高。低IR评分组患者对化疗药物敏感性更高，但高IR评分组患者的预后和生存状态更好。本研究为进一步探索ccRCC免疫疗法和开发个性化治疗奠定了基础。
发表杂志：FrontCell Dev Biol.
影响因子：6.68
本文属于单肿瘤分型思路，类似的分型文章我们也解读过很多。
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肿瘤分析文章比较重要的结论就是分型后构建的模型能够预测免疫治疗疗效。我们可以通过使用不同的数据组合或者使用不同的基因集进行分型，以确保得到的结果与免疫治疗疗效相关。如果想做类似的分析，欢迎交流。
研究背景
透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是肾细胞癌（RCC）的典型亚型，占RCC的70-80%。据统计，2019年美国ccRCC新发病例73820例，死亡14770例。目前，ccRCC最常见的治疗策略是手术干预，包括腹腔镜肾部分切除术（LPN）和根治性肾切除术（LN）。尽管早期RCC患者的5年总生存率（OS）达到90%，但转移性或晚期RCC患者的5年OS低于10%。有研究表明，包括阿西替尼、帕唑帕尼、索拉非尼和舒尼替尼在内的靶向药物在转移性ccRCC患者中取得了有效进展。PD-L1表达阳性的RCC患者对PD-1/PD-L1治疗的总体反应率更高，提示靶向治疗和免疫疗法可能对ccRCC患者有效。
流程图
ccRCC****分子亚型的鉴定
①从TCGA和ArrayExpress数据库（E-MTAB-19802）下载ccRCC的基因表达数据和临床数据。
②使用非负矩阵分解（NMF）算法根据TCGA和E-MTAB-1980数据集中的免疫相关基因表达数据对患者进行聚类。
③进行主成分分析(PCA)以确定分子亚型的稳健性和可靠性。
④比较两种分子亚型的总生存期。
⑤应用基因集变异分析(GSVA)识别两种亚型的分子功能。
结果：
下图A：聚类数从2到7的相关系数。
下图B：k=2时的共识矩阵热图。
下图C：对512例ccRCC患者进行PCA分析，每个点代表一个样本。
下图D：ccRCC中两种亚型总生存期的KM生存曲线分析。
分子亚型与肿瘤微环境
①应用ssGSEA算法评估两种ccRCC亚型样本中28个免疫细胞的浸润水平。
②使用ESTIMATE算法计算两种ccRCC亚型样本中的免疫评分、基质评分和肿瘤纯度。
结果：
下图A：ssGSEA算法在两种亚型中计算出的28种免疫细胞的浸润水平。
下图B：两种亚型间基质评分（B）、免疫评分（C）和肿瘤纯度（D）的比较。
分子亚型与免疫治疗反应
①探索已知免疫检查点在两种亚型中的表达水平，包括CD274(PD-L1)、PDCD1LG2(PD-L2)、PDCD1(PD-1)、LAG3、TIGIT和CTLA4。
②使用肿瘤免疫功能障碍和排斥（TIDE）预测算法评估两种亚型的免疫治疗反应。
结果：
下图A-F：6种免疫检查点抑制剂在两种分子亚型中的表达水平。
下图G：两种亚型之间TMB的比较。
下图H：两种亚型的TIDE评分。
分子亚型与化疗药物
①评估2种亚型对4种化疗药物（阿西替尼、帕唑帕尼、索拉非尼、舒尼替尼）的反应，并根据预测模型估算每个ccRCC样本的IC50值。
结果：
下图：4种化疗药物在ccRCC的2种分子亚型中的IC50值，包括阿西替尼(A)、帕唑帕尼(B)、索拉非尼(C)和舒尼替尼(D)。
分子亚型与免疫治疗反应及小分子化合物
①使用TIDE算法研究两种亚型是否会对免疫疗法产生反应。
②比较两种亚型的差异表达水平，鉴定差异表达基因，然后将这些基因上传到CMap数据库鉴定小分子化合物。
结果：
下图A：亚型1对PD1抑制剂更敏感。
下图B：CMap数据库分析确定针对这两个分子亚型的候选药物。
免疫相关基因特征和功能注释
①对2种亚型的DEGs进行单变量Cox回归分析确定预后DEG，并对预后DEGs进行GO和KEGG富集分析。
②基于预后DEGs进行NMF聚类分析将患者分为不同的免疫基因组亚型。
③对两种免疫基因组亚型进行生存分析和PCA分析。
结果：
下图：GO(A)和KEGG(B)富集分析以鉴定DEG的潜在功能和途径。
下图：基于274个预后DEG的NMF分析识别ccRCC的免疫基因组亚型。
下图：TCGA队列中DEG的NMF聚类将患者分为2种基因组亚型（A红色和B蓝色）。
下图A-F：CD274（A）、PDCD1LG2（B）、PDCD1（C）、LAG3（D）、TIGIT（E）、CTLA4（F）6个免疫检查点在2个基因组中的表达水平。
下图G：在2个基因组中比较28个免疫细胞的浸润水平。
构建免疫****(IR)****评分
①考虑到IR亚型的个体异质性和复杂性，作者开发了一个基于274 DEGs量化ccRCC个体患者的免疫模式评分系统，称为IR评分。
②评估IR与生存预后、临床特征之间的关系。验证IR是否可以作为独立预后因素。
③评估高低IR评分与免疫细胞浸润和免疫微环境之间的关系。
④IR评分对4种化疗药物敏感性分析。
结果：
下图A：TCGA队列中高低IR评分亚组的Kaplan-Meier曲线。
下图B：IR评分亚组的ROC曲线。
下图C：IR评分与肿瘤分级(C)和分期(D)之间的关系。
下图：ccRCC IR评分组中四种化疗药物的IC50值，包括阿西替尼（A）、帕唑帕尼（B）、索拉非尼（C）和舒尼替尼（D）。
验证****IR****评分
①检索ccRCC的无病生存(DFS)、疾病特异性生存(DSS)和无进展生存(PFS)数据集验证IR评分的预后价值。
②基于IMvigor210验证IR评分是否可以预测患者对PD-L1和CTLA-4阻断疗法的反应。
结果：
下图A：验证IR在ccRCC、E-MTAB-1980数据集(D)和IMvigor210队列(E)的DFS(A)、DSS(B)和PFS(C)中的预后价值。
下图B：低或高IR评分组中对PD-L1阻断免疫疗法有反应的患者比例。响应者/无响应者：低IR评分组中的10%/90%；高IR评分组中的25%/75%。
小结：
在这项研究中，作者基于免疫相关(IR)基因表达数据系统研究了ccRCC的IR分子异质性，并确定了两种具有不同免疫微环境特征和免疫治疗反应的亚型。此外，作者还评估了不同亚型之间化疗药物敏感性和免疫治疗反应之间的差异。最后开发出一IR评分系统用于量化ccRCC患者的免疫反应模式。这些结果有可能助于促进现阶段对肿瘤免疫浸润特征的理解，并为个性化治疗提供新的策略。
