测序知识
测序类型及原理
- 第一代DNA测序技术桑格尔-双脱氧链终止法
- 特点：读长长（1000 bp），准确性高（99.999%），通量低
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原理：桑格尔-双脱氧链终止法
- 第二代DNA测序技术-循环阵列合成测序法
- 特点：通量高、时间短、读长短
- 原理：
（1）sample prep(DNA文库构建)：将基因组DNA随机片段化，然后修补成平末端，最后加上特定的接头（Adaptors），构建成DNA文库。
（2）cluster generation（簇生成）：Flowcell上面连有两种Adaptors（P5、P7），当DNA经变性后流经Flowcell时，利用Flowcell上的接头与DNA两端的接头相互匹配。DNA进行桥式PCR扩增，从而将碱基信号放大。通过桥式PCR不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。
（3）测序
（4）数据产出
- 第三代DNA测序技术-SMRT和纳米孔单分子测序技术
SMRT技术：采用边合成边测序方法，以SMRT芯片为测序载体，芯片上众多小孔中的DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基，在碱基配对阶段，加入不同碱基会发出不同的光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。另外，若碱基存在修饰，则通过聚合酶的速度会减慢，因此可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间、两峰之间的距离来检测甲基化等碱基修饰情况。
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特点：无需PCR扩增，读长长，无视GC含量的影响
纳米孔单分子测序技术：在膜两侧施加电压，分子马达驱动DNA分子通过纳米孔，导致电荷发生变化，每种碱基引起的电流变化是不同的，通过检测这些电流进而转化为对应的碱基序列。
三代测序技术比较
名词结构化
- 基因组学作用：
（1）基因组作图（遗传图谱、物理图谱、转录本图谱）
（2）核苷酸序列分析
（3）基因定位
（4）基因功能分析
（5）其它：以全基因组测序为目标的结构基因组学；以基因功能鉴定为目标的功能基因组学 - 转录组学（基因表达分析）作用：
（1）获得物种或者组织的转录本信息
（2）得到转录本上基因的相关信息，如基因结构功能等
（3）发现新的基因
（4）基因结构优化
（5）发现可变剪切
（6）发现基因融合
（7）基因表达差异分析 - 蛋白质组学作用：
（1）蛋白质组数据处理、蛋白及其修饰鉴定（2）构建蛋白质数据库、相关软件的开发和应用
（3）蛋白质结构功能预测
（4）蛋白质连锁图 - 代谢组学作用：
（1）代谢物指纹分析
（2）代谢轮廓分析
常用数据格式
- DNA序列表征
A C G T U
R = GA（嘌呤）
Y = TC（嘧啶）
K = GT（酮）
M = AC（氨基）
S = GC
W = AT
B = GTC
D = GAT
H = ACT
V = GCA
N = AGCT（任何） - Fastq & Fasta
Fastq格式：一种基于文本的，保存生物序列（通常是核酸序列）和其测序质量信息的标准格式,一般都包含有4行。
第一行：由‘@’开始，后面跟着序列ID和可选的描述，序列ID是唯一的；
第二行：碱基序列；
第三行：由‘+’开始，后面是序列的描述信息；
第四行：第二行序列的质量评价。
Fasta格式：
1.以“>”为开头，fasta格式标志。
2.序列ID号，gi号，NCBI数据库的标识符，具有唯一性。格式为：gi|gi号|来源标志|序列标志（接收号、名称等），若某项缺失可以留空，“|”保留。
3.序列描述。
4.碱基序列，序列中允许空格、换行、空行，一般一行60个。
Fastq文件→Fasta文件
Linux命令
法1：sed '/^@/!d;s//>/;N' your.fastq > your.fasta
法2：seqtk seq -A input.fastq > output.fasta - GenBank & EMBL
GenBank格式：以LOCUS和一些注释行开始。序列的开头以“ORIGIN”标记，末尾以“//”标记。
EMBL格式：以标识符行（ID）开头，后面跟着更多注释行。序列的开头以“SQ”开头标记，序末尾以“//”标记。
GenBank & EMBL数据库格式的对比
EMBL → Fasta格式转换（在线工具）：http://www.geneinfinity.org/sms/sms_embltofasta.html
常见测序文件格式解析的网站：https://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQformat.html#format1
