按道理，featurecount应该是转录组分析中最基本的工具，但由于没有深挖其中的参数，前段时间在用它处理转录组数据时还是吃了大亏。现在将一些常用的参数记录下来：
首先在计数水平上：
分为feature和meta-feature，feature是值基因组上被定义为一个片段区域，meta-feature是指多个feature组成的区域，如exon和gene的关系，分享相同的feature identifier （GTF文件中有）的feature属于同一个meta-feature
featurecount的 "-t" 参数：设置feature-type，“-t” 指定的必须是gtf中有的feature，同时read只有落到这些feature上才会被统计到，默认是“exon”，即以exon为最小单位（feature）去回帖计数。
featurecount的 "-f" 参数：设置之后将会统计feature层面的数据，如exon-level；否则会统计meta-feature层面的数据，如gene-levels；
默认 "-f" 一般不设置，并与 “ -t exon" 结合使用，表明：在exon-level上计数，共享相同gene identifier（隶属同一meta-feature）的exon相加。否则就是在meta-feature层面上得到计数统计数据，即每一个得到的count矩阵以exon为行名。
参考：featurecounts的使用说明 - 简书 (jianshu.com)
A feature is an interval (range of positions) on one of the reference sequences. A meta-feature is a set of features that represents a biological construct of interest. For example, features often correspond to exons and meta-features to genes. Features sharing the same feature identifier in the GTF or SAF annotation are taken to belong to the same meta-feature. featureCounts can summarize reads at either the feature or meta-feature levels.
次就是链特异性的问题：
featurecounts使用参数 "-s <0|1|2> " 来定义链特异性，”0“ 表示普通文库，默认；”1“表示stranded链；”2“表示reversely stranded；
测序方案是链特异性文库。在使用Hisat2或 STAR等比对工具时，通过指明链特异性的参数，会在生成的bam文件中对每一条read添加 “ read 方向” 信息，featurecounts 通过 -s 参数来识别 read 方向，结合GTF文件判断该read 是否真的在该feature上，是否能够被计数。
通常而言，如果时链特异性文库，被当成普通文库，后续差别不大；而如果时普通文库，被当成链特异性文库，则差别就会很大。
一般转录组数据使用以下命令：
featureCounts -p -t exon -g gene_id -a annotation.gtf -o counts.txt mapping_results_SE.bam
下面用不同的参数对同一批转录组数据计数结果：###
##情况1：
featureCounts -T 5 -p -s 2 -t gene -g gene_id -a genome.gtf -o all_matrix ./*bam
#[all_matrix.summary]
Status mock.bam WT-H-11d.bam
Assigned 19515146 19585577
Unassigned_Unmapped 1678230 1482804
Unassigned_NoFeatures 18289861 18254838
Unassigned_Ambiguity 278186 434598
#Successfully assigned alignments:
mock.bam: 19515146 (43.6%)
WT-H-11d.bam: 19585577 (44.1%)
##情况2:
featureCounts -T 5 -p -t gene -g gene_id -a genome.gtf -o all_matrix2 ./*bam
#[all_matrix.summary]
Status mock.bam WT-H-11d.bam
Assigned 34510666 3451129
Unassigned_Unmapped 1678230 1482804
Unassigned_NoFeatures 789427 593567
Unassigned_Ambiguity 2783100 3170156
#Successfully assigned alignments:
mock.bam: 34510666 (77.0%)
WT-H-11d.bam: 34511290 (77.8%)
##情况3： 正常命令行
featureCounts -T 5 -p -t exon -g gene_id -a genome.gtf -o all_matrix3 ./*bam
#[all_matrix.summary]
Status mock.bam WT-H-11d.bam
Assigned 32210883 33904184
Unassigned_Unmapped 1678230 1482804
Unassigned_NoFeatures 4921182 3315212
Unassigned_Ambiguity 951128 1055617
#Successfully assigned alignments:
mock.bam: 32210883 (71.9%)
WT-H-11d.bam: 33904184 (76.4%)
从结果上可以看到：如果将普通文库当作链特异性文库（-s 2 ，情况1），会造成assigned的reads非常低，featurecount成功比对率低；
在比较feature 水平定义层面上的问题时，如果将feature level定义为 gene（-t gene，情况2），会造成Unassigned_Ambiguity非常多，且在实际的计数中会发现，all_matrix2基因数量和表达量都要低于all_matrix3（-t exon，情况3）。
根据定义：在使用 -t gene，即情况2下，以gene为最小的单位（feature）去回帖计数时，以下两种情况会被定义为Unassigned_Ambiguity；而使用exon为feature时，这种Unassigned_Ambiguity的情况则会大大减少
- Unassigned NoFeatures: alignments that do not overlap any feature.
- Unassigned Ambiguity: alignments that overlap two or more features (feature-level summarization) or meta-features (meta-feature-level summarization) ==无法确定分配到哪个基因
