Comprehensive Analysis of the Prognosis andDrug Sensitivity of Differentiation-Related lncRNAs in Papillary Thyroid Cancer
分化相关的lncRNAs在乳头状甲状腺癌中的预后和药物敏感性的综合分析。
发表期刊:Cancers (Basel)
发表日期:2022 Mar 7
影响因子:6+
doi: 10.3390/cancers14051353
一、研究背景
甲状腺癌(TC)的发病率近年来一直在增加,乳头状TC(PTC)是最常见的组织学类型,起源于滤泡细胞,占病例的85%。尽管绝大多数PTC患者通过合理的治疗如放射性碘(RAI)治疗预后良好,仍有大约10-20%的PTC患者在随访期间出现复发并转移。在这些患者中去分化是导致PTC转化为低分化或间变性TC(ATC)的主要原因。然而PTC去分化的潜在机制尚不清楚,目前的工作旨在识别一个有用的标志以指示去分化,并进一步探讨其在预后和化疗药物敏感性中的作用。
最近越来越多的研究表明,遗传和表观遗传畸变、癌症干细胞、miRNA、免疫代谢网络和自噬在PTC脱分化和RAI抗性中起着关键作用。长非编码RNA(Long noncoding RNAs,lncRNA)被定义为一系列大于200个核苷酸的转录物,被认为是转录、转录后和翻译调节各个层面的关键调节因子。它们广泛参与TC患者的致癌作用、染色质动力学、与mRNA和蛋白质的相互作用、分化和胚胎发育。值得注意的是有研究证明,lncRNA可以有效调节NF-κB和PI3K-AKT信号通路,从而影响肿瘤发生。一些研究显示lncRNA是PTCs恶性甲状腺结节诊断、预后预测和治疗反应的潜在有用生物标志物。
二、材料和方法
1.数据来源
(1)TCGA:从UCSC Xena下载甲状腺癌RNA测序(RNA-seq)数据(FPKM值)共492个TC样本和58个正常样本。
(2)GEO数据库下载微阵列数据集GSE33630。由11个ATC、49个PTC和45个正常样本组成。该数据集基于GPL570(HG-U133_Plus_2)Affymetrix人类基因组U133 Plus 2.0阵列。
(3)2020年3月至2020年6月在湘雅医院甲状腺外科接受甲状腺切除术的患者中收集了20个配对PTC样本和相邻的正常组织。
2.实验流程
三、实验结果
1.DR-lncRNA调节因子的功能和相互作用
根据已发表的文献,共有16种与分化相关的调节因子,包括NKX2-1、DUOX1-2、pAX8、SLC5A5、SLC5A8、SLC26A4、FOXE1、TG、TSHR、THRA、THRB、DIO1-2、GLIS3和TPO。 PPI网络显示TSHR是一个中心基因,可以与其他15个基因相互作用 (图1A),但Pearson相关分析显示TSHR与其他基因的相关性较弱。有趣的是,DOUX1和DOUX2具有最强的正相关(图1B)。
分析492个TC样本和58个正常样本数据发现,PTC中大多数分化相关调节因子的表达显著较低,包括PAX8,SLC5A5,SLC5A8,SLC26A4,FOXE1,TG,TSHR,THRA,THRB,DIO1-2,GLIS3和TPO,只有NKX2-1在PTC组织中过表达(图S1A)。使用Pearson相关分析筛选DR lncRNA共发现116个DR lncRNAs。其中5个DR lncRNAs被证实与总生存率相关并显示出很强的预后价值,包括CAS15、LNC00900、AC055720-2、DPH6-DT和TNRC6C-AS1,图S1B显示CAS15和TNRC6C-AS1与分化相关调节因子呈负相关,而其他三种lncRNAs则呈正相关(图S1B)。所有DR lncRNAs在PTC中异常表达(图S1C)。
2.风险评分与预后和肿瘤免疫微环境有关
构建预后模型,根据以下公式计算每个PTC患者的风险分数:风险分数=(2.43×CAS15)+(−2.22×LNC00900)+(−0.87×AC055720.2) +(3.71×DPH6-DT)+(0.28×TNRC6C-AS1)。
所有PTC患者基于风险评分中值被分为高风险和低风险两组。与高危亚组相比,低危组患者的生存时间更长(图2A)。图2B是患者生存状态和风险评分的分布。热图显示LNC00900、AC055720.2和TNRC6CAS1表达水平在低风险组显著上调(图2C)。风险得分的AUC为0.8742(图2D),表明预测性能良好。
关于PTC的免疫微环境,CIBERSORT分析显示:与低风险组相比,高风险组的嗜酸性粒细胞和活化的DC水平显著较高,而活化的肥大细胞(MC)、静止的MC和巨噬细胞M2水平较低(图S2A)。利用ssGSEA算法,发现低风险组中有大量的T卵泡辅助细胞、浆细胞样DC、未成熟DC和中央记忆CD8 T细胞(图S2B)。此外,MCP计数器进一步证实了免疫微环境与风险评分的关联,并显示低风险组的内皮细胞、中性粒细胞和CD8+T细胞的丰度明显较高(图S2C)。这些数据表明,风险评分模型可以预测预后,并与免疫细胞浸润密切相关。
3.GO和KEGG富集分析
使用Metascape进行了GO和KEGG通路富集分析。前九个GO术语是甲状腺激素生成、甲状腺激素代谢过程、激素代谢过程、含胶原的细胞外基质、顶端质膜、基底外侧质膜、糖胺聚糖结合、丝氨酸型内肽酶活性和肝素结合(图3A-C)。KEGG分析表明,细胞粘附分子(CAM)、ECM-受体相互作用、色氨酸代谢、糖胺聚糖生物合成和硫酸可拉坦与PTC的形成密切相关(图3D)
4.药物敏感性分析
作者采用了spearman相关分析,以评估药物敏感性和分化相关调节因子之间的相关性。图4A显示了统计差异最大的前8种药物。结果显示:高风险组相比,低风险组对苯达莫司汀和TAS-6417在针对分化相关调节因子方面更敏感(图4B)。图S4显示了药物的结构,这些发现突出表明该模型可被视为潜在的化疗敏感性预测因子。
5.DR-lncRNAs预后诺模图的构建
单变量分析显示PTC患者的风险评分、M1期、T4期、TNM III-IV期和年龄与总体生存率(OS)显著相关。进一步的多变量分析显示,风险评分和年龄是独立的预后因素。随后,构建了OS预测的综合诺模图(图5A)。3年期和5年期OS的AUC分别为0.966和0.967(图5B)。此外综合诺模图模型在预测3年和5年的OS方面表现出色(图5C)。DCA曲线显示,综合诺模图可以更好地预测OS,并且比年龄或风险评分具有更有利的临床适用性(图5D)。
6.DR-lncRNA表达的验证
为了验证DR lncRNAs的表达水平,作者选择GSE33630数据库在TC和正常组织之间进行差异分析。结果表明,与ATC和正常组织相比,PTC组织中LNC00900、AC055720-2和TNRC6C-AS1表达上调。随着分化程度的增加,DPH6-DT的表达水平显著上调,然而CASC15的表达水平则与分化程度呈负相关(图6A),ATC患者的风险评分最高(图6B)。TNRC6C-AS1和CAS15的表达显著高于正常组织和细胞系(p<0.001),而DPH6-DT在TC组织(图S6A)和细胞系(图S6B)中的表达显著低于正常组织和细胞系。图S6C显示,只有DPH6-DT与分化水平相关。TNRC6C-AS1和CASC15已经在PTC中进行了研究,因此,作者选择DPH6-DT进行进一步的实验。
7.DPH6-DT的下调通过激活PI3K-AKT信号通路促进细胞增殖和转移
为了探索DPH6-DT在TC中的生物学功能,作者通过转染三种siRNA将DPH6-DT敲除。其中,DPH6-DT-siRNA3有效地抑制了DPH6-DT的表达(图7A)。CCK-8分析表明,沉默DPH6-DT可显著提高细胞活力(图7B),EdU分析表明,DPH-6DT缺乏可显著增加IHH-4和KTC-1细胞中PTC细胞的增殖(图7C)。同样,当DPH6-DT沉默时,入侵和迁移增强(图7D)。此外,作者还探究了PTC中DPH6-DT-敲除的潜在机制变化。Western blot分析显示,缺失DPH6-DT可增加IHH-4和KTC-1细胞中AKT、p-AKT和PI3K的表达水平。然而,在ERK和p-ERK中没有观察到差异。此外,DPH6-DT下调还增加了上皮-间质转化(EMT)过程中波形蛋白和N-钙粘蛋白的表达。这些数据表明,DPH6-DT的敲除导致PTC中PI3K/AKT信号通路的激活。
四、结论
本研究系统地描述了DR-lncRNAs调节因子的表达模式、肿瘤免疫微环境、药物敏感性和预后价值,揭示了其在PTC患者预后和免疫细胞浸润中起着至关重要的作用,并且是药物化学敏感性的预测因子。研究表明,与正常组织相比,TC组织中DPH6-DT的表达显著降低,分化相关调节因子的大部分表达也显著降低。同时,作者证了DPH6-DT的表达水平与TC分化程度显著相关。更重要的是证实DPH6-DT可以被视为一种新的信号,通过激活PI3K-AKT信号通路来指导分化和促进TC发展,这为APT和RAI难治性TC患者的早期诊断和治疗提供了重要的依据,以改善其不良的临床预后。