细胞外囊泡(EVs)，被称为包含多种生物分子的细胞衍生的膜性结构，已被广泛应用于液体活检。由于血浆的生物组成复杂，血浆RNA组学分析(RNomics)很容易实现，因此有必要根据性能从现有方法中选择最优策略进行预期的应用
在这项研究中，我们进行了四种不同的ev分离策略并进行了比较(即超离心(UC)、尺寸排除色谱(SEC)和两种最常用的市售分离试剂盒(ExoQuick和exoEasy)。我们比较了从四种方法分离的ev中分离的rna的产量、纯度、PCR定量、miRNA-seq分析和mRNAseq分析
文章信息
- 文献标题：Extracellular vesicles isolated by size-exclusion chromatography present suitability for RNomics analysis in plasma
- Doi：https://doi.org/10.1186/s12967-021-02775-9
- 发表时间：J Transl Med (2021) 19:104
- 通讯作者：Lianmei Zhao 河北医科大学第四医院研究中心
用四种方法分离的EVs的产率和纯度的比较
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从不同方法分离的ev中提取的rna的miRNA序列分析
为了研究不同类型的RNA的表达谱，我们检测了四种方法分离的ev中的RNA测序特性。
- 从图4a的一致性结果可以看出，不同分离方法产生的RNA谱存在明显的差异，exoEasy的miRNA谱与其他三种方法相比偏差最大。由于每种方法都针对evs的不同生化特性，因此先天偏差可能会引起偏差。
- 在总测序reads中，sec衍生的RNA中mirna特异性reads的百分比最高(18-32nt)，其次是UC和exoEasy
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这些数据表明，sec衍生的RNA显示进一步生物标志物的有用miRNA测序数据的百分比最高。
用不同方法分离的ev中提取的rna的mRNA序列分析
同时对长链RNA(mRNA和lncRNA)进行RNA测序分析
- 如图5a所示，SEC和ExoQuick获得了最高的mRNA读取数(UC为7.17%，ExoEasy为8.72%，ExoQuick为47.02%，SEC为57.49%)
- 在lncRNA的结果中也观察到类似的趋势(UC：1.41%，ExoEasy：1.47%，ExoQuick：8.47%，SEC：6.78%)(图5b)
- 同时比较mRNA测序数据中的基因数。通过SEC和exoEasy获得了最大数量的定位mRNA转录本
- 进一步的分析显示，虽然在exoEasy中检测到丰富的mRNA转录本，但大多数mRNA转录本的FPKM小于5
- exoEasy在mRNA测序中检测到的大多数mRNA的丰度较低，这可能会增加进一步PCR验证的困难
- sec纯化的mRNA的mRNA测序不仅提供了最高的有用mRNA reads，而且检测到最多表达丰度的mRNA(FPKM>5或FPKM>10的mRNA)
- 对于lncRNA，四种方法中总定位的lnRNA和FPKM>为5的lncRNA的类型几乎没有差异
- 由于长链RNA测序中的大部分reads属于mRNA，而与lncRNA上的总reads不足以进行有效比较（1.41–8.47%）
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由RNA序列鉴定的长链RNA的特征
- 在评估长链rna的测序结果时，SEC和exoEasy显示出相似的比对率53.04%vs.51.05%)，而UC和ExoQuick的值分别为37.86%和34.24%
- 图6b的饼图显示，在所有这些映射reads中，SEC的外显子率远高于exoEasy(UC：4.48%，exoEasy：4.75%，ExoQuick：55.09%，SEC：63.66%)
- 然而，exoEasy和UC的大部分定位序列均富集于内含子和基因间区域。由于成熟mRNA/lncRNA中不应存在内含子和基因间基因，因此定位于外显子的reads的百分比可以反映成熟mRNA的百分比。
- 这可能可以归因于基于电荷的exoEasy将在血浆中共同分离循环中的细胞游离DNA(cfDNA)。
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