一、研究背景

1、乳腺癌的研究现状

近年来乳腺癌发病率已位居女性所有癌症类型中的第一位，其致死率居第二位，仅次于肺癌。目前对于乳腺癌具有多种治疗手段，如手术、放化疗、分子靶向治疗、内分泌治疗及免疫治疗等，这些方法较为明显的提高了早期乳腺癌患者的治愈率，虽然针对乳腺癌分子靶向治疗领域做了较多的研究，但作为一种亚型，乳腺癌干细胞(BCSCs)在乳腺癌的侵袭性、化疗耐药和肿瘤复发中起着重要作用，但其具体的分子机制研究尚不完全明确。

2、肿瘤细胞衍生的细胞外小泡（EVs）可以将分子转移到邻近细胞，以发挥致癌特性，这将是肿瘤治疗的新靶点

在此背景下，相关研究发现，BCSCs衍生的EV(BCSCs-EV)通过递送miR-197促进BC细胞的转移潜能。EVs介导的长非编码RNA（lncRNA）的递送影响受体细胞的生物学特性，这正成为包括乳腺癌在内的致癌作用的一种新的机制。有报道称，BC细胞的富含lncRNA snhg16的EV可引起BC细胞上皮-间质转化(EMT)、迁移和侵袭能力的显著升高。而ARRDC1-AS1已被报道在脑胶质瘤B的进展中发挥促瘤作用，ARRDC1-AS1在BC中表达上调，可作为这种恶性疾病的预后指标。另外AKT1抑制通过egfr介导的β-catenin核积累增强了BC的转移潜能。

二、解决的科学问题

1、ARRDC1-AS1已被报道在BC中表达上调，并可作为这种恶性疾病的预后指标，那ARRDC1-AS1在BC进展的关键节点如：BC细胞及BCSCs-EV，中的表达情况是怎样的？ 

2、如果ARRDC1-AS1在BC的进展过程相关，那ARRDC1-AS1在BC的进展中发挥怎样的作用呢（促瘤or抑瘤）？

3、LncRNAs主要调控细胞中转录水平和转录后水平的基因表达，从而影响肿瘤的生长。在转录后水平，lncRNAs通过与miRNA靶向的3’-UTR竞争性结合，将miRNA隔离释放靶基因的表达，或衍生成熟的miRNA间接调控靶基因的表达，从而发挥功能。那ARRDC1-AS1是否也通过miRNAs影响肿瘤的进展呢？

4、经过实验我们得知miR-4731-5p可通过miRNA种子序列(5'UTR处2-8 nt)与靶mRNA 3'UTR之间的互补作用靶向mRNA，直接抑制翻译，或引起mRNA不稳定，从而降解靶蛋白。那miR-4731-5p又是否通过调控靶基因参与BC恶性进展

5、通过实验我们明确了ARRDC1-AS1和miR-4731-5p的下游靶点，并形成了ceRNA调控，即ARRDC1-AS1/miR-4731-5p/AKT1，那么BCSCs-EV是否通过调控ceRNA网络影响BC细胞的恶性生物学行为呢？

6、bcscs - ev是否能够传递ARRDC1-AS1影响，进而影响裸鼠体内BC细胞的生长？

三、目的和意义

在本研究明确了乳腺癌干细胞源性细胞外囊泡(BCSCs-EV)在BC中传递ARRDC1-AS1的致癌机制，ARRDC1-AS1促肿瘤作用的发现为BC的机制提供了新的见解，有助于临床进一步研发以ARRDC1-AS作为靶点治疗BC的手段。

四、研究内容和结果

1、ARRDC1-AS1在BC细胞和BCSCs-EVS中高表达

A.检索exoRBase数据库，在BC患者的血源性EVs中获得了92个上调的lncrna(≥2倍)。

B .bcsc相关数据集GSE151191的差异分析鉴定出55个上调的lncrna(≥10倍)。

C.对来自exoRBase数据库和GSE151191数据集的lncrna进行交叉分析，发现了两个候选lncrna (HOTAIRM1和ARRDC1-AS1)。

D.只有ARRDC1- AS1在TCGA数据库的BC样本中较正常样本显著高表达(p < 0.001;)。

E.在exoRBase数据库中，ARRDC1-AS1在BC患者血源性EVs中的表达也增加(p < 0.01)。

F.为了进一步验证，RT-qPCR检测了人正常乳腺上皮细胞MCF-10A和BC细胞MCF-7、MDA-MB-MB-453和SK-BR-3中ARRDC1-AS1的表达。结果显示，ARRDC1-AS1在BC细胞中的表达高于MCF-10A细胞，其中MCF-7细胞中ARRDC1-AS1的表达最高。

2、沉默BCSCs中ARRDC1-AS1抑制BC细胞的恶性表型。

A.选择ARRDC1-AS1表达最高的MCF-7细胞用于流式细胞仪的细胞分选。相应地获得了BCSC CD44+ CD24-亚群。

B、C.从BCSCs中提取EVS，并用透射电子显微镜和NTA进行鉴定。大多数EV是直径约100 nm的脂双层包裹的囊泡。

D.Western印迹分析显示EVS标记CD63、TSG101和CD81为阳性，而非EVS标记如Calnexin为阴性。（这些结果表明成功地提取了BCSCs-EVS）。

[if !supportLists]E. [endif]免疫荧光显微镜下观察BC细胞摄取BCSCs-EVS的情况，结果显示大量BCSCs-EVS进入BC细胞并分布在细胞核周围,这一结果确保了EVS携带的RNA也进入细胞发挥相应的生物学功能。

F通过RT-qPCR验证了针对ARRDC1-AS1的沉默效果最好的sh-ARRDC1-AS1-1，经sh-ARRDC1-AS1处理的BCSCs和BCSCs-EVS中ARRDC1-AS1的表达都降低。

G.RT-qPCR结果显示，与EVS或EVS-sh-NC共培养的BC细胞中ARRDC1-AS1的表达比对照BC细胞高2倍以上，而与EVssh-ARRDC1-AS1共培养的BC细胞中ARRDC1-AS1的表达水平与对照细胞相近。

H，I，K，L.此外，CCK-8试验、Transwell试验和流式细胞仪检测显示，EVS或EVS-sh-NC与BC细胞共培养时，BC细胞的增殖、迁移和侵袭均被促进，细胞凋亡率被抑制(相对于对照组>60%)，而EVS-sh-ARRDC1AS1可取消这些作用。

J.谷氨酸水平与肿瘤侵袭能力的变化密切相关,谷氨酸检测试剂盒检测BC细胞培养液中谷氨酸的浓度。结果表明，与EVS(51%)或EVS-sh-NC(45%)共培养的BC细胞培养液中谷氨酸浓度比对照细胞升高，而沉默ARRDC1-AS1使其浓度比与EVS-sh-NC共培养时降低25%.

3、ARRDC1-AS1与BC细胞中miR-4731-5p的竞争性结合

A、基于从GEO数据库获得的BC相关miRNA数据集GSE57897进行了miRNA的差异表达分析。结果产生了53个显著下调的miRNAs(≥10倍)。

B、ENCORI数据库预测了可能与ARRDC1-AS1结合的miRNAs，然后与从GSE57897数据集中获得的显著下调的miRNAs相交，只产生一个候选miRNA，即miR-4731-5p。

C、RIP试验与RT-qPCR相结合表明，ARRDC1-AS1的浓缩水平显著提高了3.8倍，证实了与ARRDC1-AS1结合的miRNAs的存在。

D、Bio-miR-4731-5P-WT组的ARRDC1-AS1浓缩水平是生物探针-NC组和Bio-miR-4731-5P-MUT组的3倍。

E、FISH数据显示，ARRDC1-AS1和miR-4731-5p共同定位于BC细胞。

F、Starbase数据库预测到ARRDC1-AS1和miR-4731-5P的结合位点的存在，然后使用定点突变获得ARRDC1-AS1-MUT。

G、进一步的双荧光素酶报告基因分析表明，miR-4731-5p模拟物降低了ARRDC1-AS1-WT的荧光素酶活性，但不影响ARRDC1-AS1-MUT的荧光素酶活性。（这些结果表明，ARRDC1-AS1可以作为miR-4731-5P与AGO2结合的平台）。

H、I检测ARRDC1-AS1表达变化对miR-4731-5p的影响。

G、RT-qPCR验证了ARRDC1-AS1的过表达或沉默效率(均>2倍)。

K、RT-qPCR结果显示，sh-ARRDC1-AS1处理的BC细胞miR-4731-5p的表达比sh-NC处理的细胞增加，而OE-ARRDC1-AS1处理的BC细胞miR-4731-5p的表达比OE-NC处理的细胞减少

4、miR-4731-5P靶向并抑制BC细胞AKT1

A、对BC相关基因数据集GSE80754进行了差异分析，获得了845个显著上调的基因(≥10倍)

B、通过ENCORI和TargetScan数据库预测miR-4731-5p的靶基因，它们与GSE80754数据库中显著下调的基因相交。获得了110个候选靶基因

C、蛋白质-蛋白质相互作用分析表明，AKT1是相互作用网络中的核心蛋白质

D E、基于miR-4731-5P与AKT1 3‘UTR的结合部位，以及双荧光素酶报告基因分析，进一步证实了miR-4731-1-5P模拟物抑制了AKT1-WT的荧光素酶活性。

F、ARRDC1-AS1和miR-4731-5p的同时增加降低了总AKT1蛋白水平和AKT1磷酸化程度，与对照组接近。（因此，AKT1是miR-4731-5p的靶基因）。

5、BCSCs-EVS可以调节ARRDC1-AS1/miR-4731-5p/AKT1，促进BC细胞的恶性表型。

A B.经sh-NC+EVS联合培养的BC细胞，ARRDC1-AS1和AKT1的表达增加(2.5倍)，miR-4731-5p的表达降低(62%)，而经sh-AKT1处理后，AKT1的表达降低，而对ARRDC1-AS1和miR-4731-5p的表达无影响。在sh-AKT1+EVS存在下，ARRDC1-AS1和miR-4731-5p的表达在BC细胞中没有显著差异，AKT1的表达低于sh-NC+EVS处理。（以上结果提示，EVS携带的ARRDC1-AS1在一定程度上通过抑制miR-4731-5而拮抗AKT1的沉默作用）

C D F G.根据CCK-8试验、Transwell试验和流式细胞仪的结果，与sh-NC共培养相比，sh-NC+EVS可促进BC细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡，而这些作用可被sh-AKT1取消；但sh-AKT1+EVS减弱了sh-AKT1对BC细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，以及对细胞凋亡的促进作用。

E.与Sh-NC+EVS共培养后，BC细胞培养液中谷氨酸浓度较与Sh-NC共培养时升高，而AKT1的沉默降低了谷氨酸浓度。EVS和sh-AKT1联合处理导致谷氨酸浓度比sh-AKT1处理增加1.9倍。

6、BCSCs-EVS通过携带ARRDC1-AS1促进裸鼠BC细胞的成瘤

A.建立BC裸鼠模型，分别注射EVS、EVS-sh-NC或EVS-sh-ARRDC1-AS1。结果发现，与对照组相比，注射EVS的小鼠肿瘤组织中ARRDC1-AS1和AKT1的表达增加了2倍，而miR-4731-5p的表达降低了76%。

B.与注射EVS-sh-NC相比，注射EVssh-ARRDC1-AS1将ARRDC1-AS1和AKT1的表达降低到与对照组小鼠相似的水平，并上调了小鼠肿瘤组织中miR-4731-5p的表达。

C E.注射EVS的小鼠的肿瘤体积和重量比对照组增加；EVS-sh-ARRDC1-AS1治疗与EVS-sh-NC治疗的结果相反。

F G. EVS-sh-ARRDC1-AS1导致了与EVS-sh-NC处理相反的结果(Ki67阳性细胞减少33%，TUNEL阳性细胞增加2.8倍)

五、总结

含有ARRDC1-AS1的BCSCs-EV通过与miR-4731-5p竞争结合上调AKT1的表达，从而促进BC细胞的恶性进展。

六、优缺点

1、具有重要临床意义：有助于临床进一步研发以ARRDC1-AS作为靶点治疗BC的手段。

2、可参考作者既新颖又严谨实验设计思路：通过其他肿瘤模型，寻找BC的潜在治疗靶点，利用lncRNAs与miRNA之间的关系，寻找到新靶点的下游因子，并通过生物学分析等多种实验方法来验证，进而探究出乳腺癌干细胞源性细胞外囊泡(bcscs - ev)在BC中传递ARRDC1-AS1的致癌机制。

3、可参考作者的方法学：生信分析寻找可靠的下游靶点、cck-8检测细胞活力、Transwell探究肿瘤细胞迁移、流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡情况、免疫组化染色法、采用荧光原位杂交(FISH)测定经EVs与BC细胞共培养后是否成功提取BCSCs-EVS等多种实验方法。