材料：
动物：SPF级6周雌性的Balb/c小鼠；小鼠乳腺癌细胞系4T1或者MDA-MB-231细胞，293T细胞
试剂：RPMI 1640(Biological Industries公司);0.25% Trypsin、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液和Opti-MEM(Gibco公司); VivoGloTM Luciferin和D-luciferin(Promega公司);苏木精染料和伊红染料(ZSGB-BIO公司);转染试剂，Lipofectamine2000(Invitrogen公司);Polybrene 助感染试剂(Sigma-Aldrich公司)。
方法：
- 细胞培养：
4T1细胞系在含有10%胎牛血清和100 U/mL青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中培养。培养温度为37 ℃,气体环境为5% CO2/95%空气，湿度为饱和。对于细胞传代，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，并以1∶3的比例进行传代培养。 - 慢病毒包装和稳转细胞系的构建：
为了实时观察体内的转移情况，本研究构建稳定表达luciferase的细胞系。转染前1 d将293T细胞铺入6孔板内，待细胞汇合度达到70%左右时进行转染。
将luciferase表达质粒和pLP1、pLP2和pLP/VSVG慢病毒穿梭质粒和辅助包装原件载体质粒按照分子质量计算DNA用量，总计2 μg DNA。将2 μg DNA稀释于100 μL Opti-MEM培养基中混匀后静置5 min, 同时将2 μL Lipo2000转染试剂置于100 μL Opti-MEM培养基中混匀后静置5 min。再将200 μL转染工作液加入培养液中混匀后置于37 ℃,5% CO2培养，4～6 h后换液。半量体积的培养基培养48 h, 荧光显微镜下观察转染效率,收集上清, 3 000 r/min离心15 min, 取上清，6孔板感染4T1细胞. 在不含双抗的完全培养基中，每孔加入1 mL病毒原液并添加2 μg/mL的助感染试剂polybrene, 6 h后换液。感染病毒后的细胞增殖汇合达到80%时，更换为新鲜的含嘌呤霉素（ 2 μg/mL ）的培养基处理细胞。直至未感染的空白对照组细胞全部死亡后，更换完全培养基进行扩大培养。抗性基因进行筛选，在转染3-4天进行加药，连续加药2周得到稳定的4T1-luc
3.自发性肺转移模型的建立
将处于对数增殖期的小鼠乳腺癌细胞4T1-luc用0.25% EDTA的胰蛋白酶消化，1 000 r/min离心5 min, 用生理盐水或PBS重悬制备单细胞悬液,将细胞调整到1.5×107 /mL。
首先确认麻醉雌性小鼠对脚趾捏缺乏反应，并将动物的四肢贴在手术板上。使用无菌棉签用洗必泰、碘和 75% 乙醇对手术区域进行消毒。并在前胸壁中间做一个五毫米的皮肤切口。提起靠近切口的右侧皮肤，并使用无菌显微剪刀将皮肤与胸壁分离。翻开皮肤以暴露右侧的第四对乳腺脂肪垫，并使用配备 28.5 号针头的 1 毫升胰岛素注射器，小心地将 100 ul癌细胞【 1.5×106个细胞】悬浮液通过伤口注入脂肪垫.针头停留五秒钟，让凝胶状癌细胞蛋白混合物凝固，拔出针头，用无菌 5-0 不可吸收缝线关闭切口。然后将动物放在一个干净的笼子里进行监测
每只Balb/C裸鼠于左前肢腋下【第四对乳腺脂肪垫】接种1.5×106个细胞【即100ul】。 - 实验性肺转移模型的建立
每只SCID鼠经尾静脉注射1.5×106个细胞, 每周对小鼠的生活状态进行观察
5.成瘤并进行原位肿瘤切除术
每隔1 d对裸鼠的成瘤情况进行观察, 并测量裸鼠体质量和瘤体的长径和短径。
癌细胞接种后8天【看成瘤情况】要进行乳房切除术，固定小鼠，在癌细胞接种的手术疤痕左侧两毫米处做一个5毫米的皮肤切口。将切口向前肢根部延伸，切除肿瘤，以及皮肤，包括手术疤痕，和与肿瘤接触的病变，以及腋窝淋巴结。然后用无菌的5-0不可吸收缝合线将皮肤缺损处缝合成Y字形。将动物放回笼子里，并进行监测
6.小动物活体成像检测体内转移情况：
小动物超声/CT检测肺转移情况
荧光成像
使用PBS配制150 mg/mL的D-luciferin储存液(10×工作液),-80 ℃保存。实验前，使用PBS稀释D-luci-ferin储存液至1×工作液。将荷瘤小鼠放置于麻醉箱通入异氟烷麻醉。
腹腔注射D-luciferin工作液(10 μL/g),10 min后将小鼠放置于活体成像箱中进行成像拍照，并且记录数据。 - 摸索时间，选择B超/CT未检测出但荧光成像存在时进行肺部组织石蜡包埋和HE染色
将安乐死的小鼠手术取出肺组织后，立即放入4%多聚甲醛溶液中固定2 d。流水漂洗组织块后，使用梯度浓度的乙醇溶液脱水组织，然后使用二甲苯进行透明处理，浸蜡后将组织整理包埋于石蜡块中。
对包埋材料进行修整后，固定在切片机上，4 μm组织切片，将切片于温水中展片，并用载玻片从一侧捞片后放置于60℃的烤片机上烤干。
将石蜡包埋的切片浸入梯度浓度的乙醇中进行脱蜡处理。复水后，依次用苏木精染色，用盐酸乙醇进行分化，用氨水漂洗返蓝，脱水后再用0.5%伊红乙醇溶液复染。
在每张载玻片上滴一滴中性树脂，并覆盖盖玻片。制好的玻片在显微镜下观察，对核质深染的区域进行拍照统计。
