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本文的思路是通过WGCNA分析识别了某种免疫细胞相关的marker基因，然后利用这些基因进行预后模型的构建。事实上，预后模型的文章已经不好发了，甚至有的审稿人看到预后模型就反感，因为实在是太多了，而且预测效能普遍不行。那么如何做的比这篇文章还要好呢？鉴于最近泛癌分析以及肿瘤分型分析比较好发，小编做的免疫细胞marker的泛癌分析以及肿瘤分型，内容是这些文章的2倍以上，均发表到8+杂志。所以我们在结合单细胞分析筛选某种免疫细胞特有的marker基因，对这些基因进行泛癌分析或者肿瘤分型分析。在分型分析中再附上简单的预后模型，但不以其为重点。这样的思路肯定是比本篇文章内容更多，更新颖。如果想做类似分析，欢迎交流。
研究背景：
黑色素瘤是一种具有早期转移的高度侵袭性皮肤癌，在皮肤癌中死亡率最高。尽管最近新辅助免疫治疗、化疗和靶向治疗的进展改善了患者的预后，但许多患者只能获得暂时的缓解，并最终产生治疗耐药。骨髓来源的细胞穿透肿瘤并分化成被称为肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的巨噬细胞，它是肿瘤充气白细胞的主要成分。为了对黑色素瘤患者中M2-like TAM浸润的分子特征提供新的认识，基于皮肤黑色素瘤(TCGA-SKCM)数据集中与M2-like TAM浸润最相关的基因模块确定了两个不同的聚类(Cluster 1和Cluster 2)。VARS1被认为是与M2-like TAM浸润最相关的模块的枢纽基因，这表明VARS1与TAM极化可能是黑色素瘤发展的一个新的潜在靶点。
研究结果：
一、M2的TAM相关基因模块的识别
1、在TCGA和GSE98394数据集中，作者使用CIBERSORT 算法评估M2巨噬细胞浸润比例，并发现M2巨噬细胞浸润比例较高的患者预后较差(图1a)。
2、接着作者使用WGCNA方法，识别与M2细胞浸润相关的基因模块。热图显示，在TCGA-SKCM中，黄色模块与CD8 + T细胞和M2巨噬细胞的浸润分别呈负相关和正相关(图1B)。
3、作者随后通过单因素回归分析筛选到125个与OS相关的基因。基于125个预后基因，使用R ConsensusClusterPlus包对TCGA-SKCM数据集进行一致聚类，并确定了两个聚类:聚类1(319例)和聚类2(148例)(图1 C)。
4、Cluster 1的OS结果比Cluster 2更差(log-rank p = 0.0071，图1D)。
二、功能和多组学分析
1、图2A描述了每个集群中富集的前20条路径。
2、与簇2相比，簇1包含更高比例的角蛋白亚型(57% vs. 13%)和更低比例的免疫亚型(34.7% vs. 56.2%)(图2B)。GSEA显示，M2巨噬细胞通路在聚类1中富集(图2C)。免疫检查点基因的差异表达检测显示，与聚类1相比，聚类2的免疫检查点相关基因表达更高(图2D)。
3、研究每个集群中的突变，用瀑布图突出显示了两个集群中最显著突变的前20个基因(SMGs)(图3A, 3B)。
4、簇1共包含56个焦点缺失峰和69个焦点放大峰，簇2包含37个焦点缺失峰和28个焦点放大峰(图4A, 4B)。
5、使用R ChAMP包与FDR 分析两个簇间甲基化差异，得到簇1和簇2间差异甲基化探针(DMPs) 28,870个。簇1的CD8A和HAVCR2的甲基化水平比簇2高(图4C)。
三、M2巨噬细胞簇相关预后模型的构建
1、研究了两个类群之间的差异基因，基于单基因回归分析--Lasso回归分析--多因素回归分析，构建了预后模型(图5A)。
2、风险评分越高的患者OS预后越差，Cluster 1患者风险评分越高(图5B-C)。
3、AUC表明，M2巨噬细胞集群相关风险评分在预测TCGA数据集中黑色素瘤患者的OS方面具有潜在价值(图5D)。
4、为了验证模型的预后意义，在一个验证队列(GSE65904)中使用相同的模型评分阈值计算风险评分，结果相似，风险评分越高的患者OS越差，风险评分具有预后价值(图5E-F)。
四、高危组与低危组免疫细胞浸润和免疫基因表达的差异
1、高危组与低危组免疫细胞浸润的比较（图5G）。
2、与TCGA数据集的低风险评分组相比，高风险评分组的抗原递呈和免疫检查点相关基因的表达明显增加(图6A-C)。
3、为了进一步观察高风险评分组和低风险评分组对免疫治疗反应的差异，发现高风险评分组对免疫治疗无反应的比例高于低风险评分组(64%：28%)。(图6 D)。
五、VARS1作为黄色模块的枢纽基因及其在黑色素瘤进展和巨噬细胞极化中的作用
1、维恩图显示M2相关模块的枢纽基因与DepMap数据库中对黑色素瘤人类细胞系生长至关重要的基因的交集，通过与四种PPI识别hub基因方法获得的基因集进行交集，得到VARS1(图7 A)。
2、在TCGA数据集中，高VARS1表达与较短的OS相关(图7B)。
3、GSE115978数据集的单细胞RNA-seq结果显示，VARS1主要在肿瘤细胞中表达，而不在基质细胞和免疫细胞中表达(图7C)。
4、过表达VARS1促进了细胞的迁移和侵袭能力，而抑制VARS1则显著降低了这种能力(图7D-F)。
5、GSEA表明，在TCGA-SKCM数据集中，高VARS1水平与转移相关通路呈正相关(图7G)。
六、VARS1与免疫浸润和诱导的M2巨噬细胞极化呈负相关
1、KEGG通路显示，在VARS1低表达的患者中，免疫相关通路如T细胞受体通路富集，而在VARS1高表达的患者中，肿瘤生长通路如细胞周期通路和mTOR通路富集(图8 A)。
2、VARS1表达与肿瘤内M2巨噬细胞浸润呈正相关，与M1巨噬细胞浸润和CD8T细胞浸润呈负相关(图8B-C)。
3、流式细胞术显示，与载体a375上清处理的THP1细胞相比，使用VARS1-A375上清处理的THP1细胞中M2巨噬细胞标志物CD206的表达增加了3倍，而M1巨噬细胞标志物CD86的表达减少了15.2%(图8D)。
七、高VARS1表达与低CD8 T细胞浸润相关，预测免疫检查点封锁的临床效果差
1、在TCGA-SKCM数据集中，VARS1的高表达与CD8T细胞浸润呈负相关(图9A)。
2、在TCGA和GSE65904数据集中，许多免疫检查点基因的表达与VARS1的表达呈负相关(图9B)。
3、VARS1的低表达预示着对抗pd -1免疫治疗的部分应答(PR)，而VARS1的高表达预示着对抗pd -1免疫治疗的耐药(SD)(图9C)。
总结：黑素瘤被认为是最具侵袭性的皮肤癌类型，对免疫治疗特别敏感，例如使用CTLA4和PD-1拮抗剂进行免疫检查点封锁。免疫治疗可以明显改善患者的预后，特别是对于IV期黑色素瘤患者，但一旦患者产生免疫治疗耐药性，死亡率将变得相当高。尽管如此，解决和预测黑色素瘤免疫治疗反应的目标已经达到。考虑到大量研究已经证明了TAMs在黑色素瘤的临床结果和免疫治疗耐药中的重要性，本研究应用WGCNA首次识别了黑色素瘤中一个M2样TAM模块，并检验了M2样TAMs作为黑色素瘤预后标志物和预测免疫治疗反应的可靠性。
