E6AP 是一种 HECT 结构域泛素连接酶（E3），通过泛素‑蛋白酶体途径介导底物蛋白降解。该基因母源突变导致 Angelman 综合征（AS），同时 E6AP 可与 HPV 16/18 型 E6 蛋白结合，促进 p53 降解，参与宫颈癌发生。由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗E6AP抗体亲和纯化（货号：A300-352A）经抗原亲和纯化，特异性识别 人 E6AP 蛋白第 400–450 位氨基酸 区域，适用于免疫沉淀（IP）和免疫印迹（WB），并交叉识别小鼠 E6AP。本文从产品规格、免疫原设计、实验操作方案、功能背景及故障排查等方面提供系统技术参考。
一、产品基本规格与储存信息
参数| 内容|
靶标| E6AP / UBE3A
反应性 | 小鼠、人类
应用| IP、WB
宿主/克隆性 | 兔 / 多克隆
形式| 完整 IgG
免疫原 | 第400至450位氨基酸之间
亚型| IgG |
标记物 | 未标记
纯度| 抗原亲和纯
抗原种属 | 人类
浓度| 1000 µg/ml（1 mg/ml）
保存条件 | 2 – 8 °C
有效期 | 自收货之日起 1 年
缓冲液 | Tris-柠檬酸/磷酸缓冲液，pH 7–8，含 0.09% 叠氮化钠
储存与操作提示：
抗体须始终保存于 2–8 °C，严禁冷冻，冷冻会导致蛋白聚集和效价下降。
叠氮化钠作为防腐剂，可能抑制 HRP 活性；若用于活细胞或体内实验，需通过脱盐柱去除。
抗体浓度经比尔定律标定（A280 = 1.4 对应 1 mg/mL IgG），方便用户精确稀释。
二、推荐应用与实验条件
免疫印迹（Western Blot, WB）
推荐稀释范围：1:1,000 – 1:10,000（宽稀释窗口适应不同表达丰度样本）
封闭液与抗体稀释液：5% 脱脂牛奶 / TBST
一抗孵育：4 °C 过夜（推荐）
二抗推荐：Goat anti‑Rabbit IgG (H+L) HRP（A120-101P）
检测方式：增强型化学发光（ECL）
WB 优化流程
1. 样本制备：
阳性对照：HeLa、HEK293 或 小鼠脑组织裂解液（小鼠 E6AP 在脑高表达）。
裂解液：RIPA 缓冲液（含蛋白酶抑制剂），E6AP 分子量约 100 kDa。
上样量：20–30 μg 总蛋白。
2. 电泳：使用 8% SDS‑PAGE 或 4–12% 梯度胶。
3. 转印：PVDF 膜，250 mA 恒流 90 分钟。
4. 封闭：5% 脱脂牛奶 / TBST，室温 1 小时。
5. 一抗孵育：用 5% 牛奶 / TBST 按 1:1,000 – 1:10,000 稀释（首次建议 1:2,000）。
6. 洗涤：TBST 洗涤 3 × 10 分钟。
7. 二抗孵育：HRP‑山羊抗兔（1:10,000–1:20,000），室温 1 小时。
8. ECL 检测。
预期结果：应在约 100 kDa 处检测到单一条带。若出现多条带（常见约 75 kDa、50 kDa），可能为降解产物；建议提高一抗稀释度至 1:5,000 或 1:10,000，并确保样本新鲜。
免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）
用量：6 μg 抗体 / mg 总蛋白裂解液
裂解液要求：使用 非变性裂解缓冲液（如 50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP‑40, 不含 SDS），添加蛋白酶抑制剂。
IP 详细步骤
1. 细胞裂解：收集 1–2 个 10 cm 皿细胞（约 5–10 × 10⁶），加入 500 μL IP 裂解液，冰上裂解 30 分钟，离心取上清。
2. 蛋白定量：BCA 法测定裂解液浓度。
3. 预清除（可选）：加入 20 μL Protein A/G 磁珠，4 °C 旋转 1 小时。
4. 抗体结合：取 1 mg 总蛋白，加入 6 μg A300-352A 抗体，4 °C 旋转孵育过夜。
5. 捕获复合物：加入 30 μL Protein A 磁珠，继续孵育 2 小时。
6. 洗涤：用 IP 裂解液洗涤磁珠 4–5 次。
7. 洗脱：加入 30 μL 2× SDS 上样缓冲液（含 DTT），95 °C 加热 10 分钟。
8. WB 检测：取上清进行 SDS‑PAGE。
IP‑WB 的特殊注意事项
E6AP 分子量约 100 kDa，远高于抗体重链（≈55 kDa），理论上常规抗兔 H+L 二抗不会干扰。但为确保最洁净背景（尤其检测低丰度互作蛋白时），仍推荐使用 抗兔 IgG 轻链特异性 HRP 二抗，并在封闭液中添加 5% 正常猪血清（货号 S100‑020），以彻底消除重链信号。
IP 阳性对照：可使用已知与 E6AP 相互作用的蛋白（如 HPV E6、p53）进行共沉淀验证。
三、该抗体的核心优势
人/小鼠交叉反应性：无需分别采购不同种属抗体，尤其适合转基因小鼠模型及 AS 研究。
亲和纯化低背景：WB 可实现 1:10,000 稀释，IP 背景干净。
配方化 IP 用量：6 μg/mg 裂解物，避免抗体过量浪费。
宽 WB 稀释窗口（1:1,000–1:10,000）：适应高表达（肿瘤细胞）和低表达（部分原代细胞）样本。
液态稳定保存：2–8 °C 一年，无需分装冻融。
表位位于 HECT 上游：不影响识别天然构象，可用于 IP 检测蛋白复合物。
四、汇总信息表（快速参考）
应用稀释速查：
WB：1:1,000 – 1:10,000（5% 牛奶/TBST，4 °C 过夜）
IP：6 μg/mg 裂解物
二抗推荐：
WB 常规：Goat anti‑Rabbit IgG (H+L) HRP（A120-101P）
IP‑WB：anti‑Rabbit IgG Light Chain HRP + 5% 正常猪血清（S100‑020）
阳性对照：HeLa 细胞（人）、小鼠全脑裂解液（鼠）
储存：2–8 °C，严禁冷冻；有效期 1 年
