许多重要的农艺性状为数量性状，由多个基因位点控制。利用传统的分子标记技术进行基因定位，常常需要花费较长的时间和大量的人力物力。2012年日本岩手大学（Iwate university）的科学家Ryohei Terauchi 和他的团队在Nature biotechnology上发表了Mutmap方法，该方法利用混池重测序可以快速实现基因定位，大大提高了遗传定位的效率。

Ryohei Terauchi 等于2012年发表于nature biotechnology上的文章

并在Iwate biotechnology research center上发布了mutmap的pipeline和protocol。

网站地址：http://genome-e.ibrc.or.jp/home/bioinformatics-team/mutmap

Iwate biotechnology research center 网站mutmap主页

1 利用Mutmap进行基因定位的原理

1)对已有参考基因组的野生型材料进行诱变，产生突变体材料，例如使用EMS进行诱变处理。

2）利用突变后代进行自交，直到得到纯合稳定的突变后代。对携带重要农艺性状或感兴趣的性状的纯合突变体进行研究。

3)将选出来的突变体与野生型进行杂交，产生的F1进行自交产生F2（>100），对F2植株进行表型鉴定。

4）在F2群体中，大部分的位点的野生型/突变体SNP、Indels的分离比为1:1，但是在纯合突变表型的F2个体中与控制表型的位点连锁越紧密的SNP出现突变体型的SNP的概率越高，突变体型的SNP概率范围为50%~100%。

5）将F2群体中表现为突变体表型的植株进行混池测序（Sequence the bulked DNA）。

6）利用SNP index=含有突变体型SNP的reads数目/所有比对到该位点的reads数，SNP index值越趋近于1，该SNP与目的基因位点连锁越紧密，SNP index 值越趋近于0.5，该SNP与目的基因位点距离越远。

7）测序深度、突变体混池群体大小、表型分裂和鉴定都会影响最终SNP index的结果。作者在supplementary data中利用统计学方法对这些因素进行分析，帮助判断哪些SNP index值较高的SNP为假阳性位点。

7.1）混池测序植株数目和测序深度的影响（Fig S 1）

假设n为进行bulk sequencing 的植株数，G为测序深度。通过统计学分析可以得出，测序深度G一定时，增加n可以显著将降低SNP index的变异程度，当n一定时增加G，虽然也可降低SNP index的变异程度，但降低的水平较小。

Figure S1

因此可以通过增加混池测序植株数目n或提高测序深度，来降低假阳性出现的概率。

7.2）表型鉴定误差的影响（Fig S 2）

在混池测序时，应准确选取突变表型的植株。如果将表型为野生型的个体混入，就会降低casual SNP 的 index值，从而造成假阴性的错误。为此作者假设错误表型个体混入的植株数目为j，混池测序植株数目为n，测序深度为G。从图A可知，G和n固定，随着j的增大，SNP index逐渐向左移，且方差变大。由图B可知，n和j固定增加测序深度，可以显著降低方差，且high SNP index数量增加。由图C可知，j/n固定，随着n的增加，SNP index的分布变化不大。

由此，当池中混入野生型个体时，应提高测序深度G来降低假阴性的概率。

此外，作者还指出，使用全基因组较少的SNP数目，可以提高准确性，因此应选取高质量的SNP位点进行后续分析。casual SNP附近出现的high SNP index的SNP cluster，可以帮助判断casual SNP的真实性。

Figure S2

2 利用Mutmap方法对水稻浅绿色叶片突变体进行遗传分析

作者利用Mutmap方法对

3 分析流程

所有分析操作均在Mutmap protocol中，此处仅写出主要步骤及注意事项。

1）Protocol、pipeline及数据下载

1.1）protocol和pipeline：http://genome-e.ibrc.or.jp/home/bioinformatics-team/mutmapa

Mutmap pipeline和protocol下载

1.2）日本晴参考基因组：

https://rapdb.dna.affrc.go.jp/download/archive/irgsp1/IRGSP-1.0_genome.fasta.gz

http://rice.plantbiology.msu.edu/pub/data/Eukaryotic_Projects/o_sativa/annotation_dbs/pseudomolecules/version_7.0/all.dir/all.chrs.con

1.3）野生型测序数据和突变体混池测序数据：

建议使用lftp进行下载

如：lftp ftp://ftp.ddbj.nig.ac.jp/ddbj_database/dra/fastq/DRA000/DRA000499 -e "mirror -c --parallel=3;exit"

野生型和混池数据下载地址

2）数据压缩及重命名

数据压缩及重命名

重命名的规则*_[0~9]_[1,2]_sequence.txt.gz

其中*为样品的名称或自己想要的标记（可将后续操作中anyname、mybulk目录修改为*），[0~9]为测序时flow cell的编号，[1，2]此处只能填写1或2，为双端测序的read1和read2。

3）参数设置

3.1）建立原始文件链接

在/myhome/MutMap_test/1.qualify_read/anyname和cd /myhome/MutMap_test/1.qualify_read/mybulk目录下，利用ln -s分别建立原始测序数据链接 。

3.2）添加参考基因组fasta文件

cp public.fasta /myhome/MutMap_test/downloaded_fasta/

3.3）编辑config.txt修改pipeline参数

按照protocol中的要求修改~/MutMap_test/config.txt中的参数。

3.4）运行Bat_make_common.fnc.sh文件

./myhome/MutMap_test/Bat_make_common.fnc.sh

运行后，会在/disk5/mwang/mutmap/MutMap_test/1.qualify_read/anyname（和mybulk）/q30p90/下产生sep_pair目录，对于后续运行重要。

4）通过SNP替换产生野生型的参考基因组

第一步，利用BWA将过滤后的野生型双端测序数据比对到日本晴基因组上。

第二步，用比对产生的SNP对日本晴参考基因组进行替换，产生野生型的参考基因组。

第三步，将被过滤的reads