从山中四因子OSKM中排除 Oct4 可以释放 iPSC 的发育潜力
Excluding Oct4 from Yamanaka Cocktail Unleashes the Developmental Potential of iPSCs - PubMed (nih.gov)

亮点

• SKM 可以在没有外源性 Oct4 的情况下在体细胞中诱导多能性
• SM 共表达激活体细胞中的逆转录病毒沉默机制
• Oct4 过表达在重编程期间驱动大量脱靶基因激活
• OSKM，而不是 SKM，iPSC 显示出异常的印记和分化模式

摘要

Oct4 被广泛认为是四个 Yamanaka 重编程因子中最重要的一个。在这里，我们展示了 Sox2、Klf4 和 cMyc (SKM) 的组合足以将小鼠体细胞重编程为诱导多能干细胞 (iPSC)。在成纤维细胞中同时诱导 Sox2 和 cMyc 会立即触发逆转录病毒沉默，这解释了与先前研究的差异，这些研究试图但未能使用逆转录病毒载体在没有 Oct4 的情况下生成 iPSC。 SKM 诱导可以部分激活多能网络，即使在 Oct4 敲除的成纤维细胞中也是如此。重要的是，在没有外源 Oct4 的情况下重新编程会大大提高 iPSC 的发育潜力，这取决于它们在四倍体互补试验中产生全 iPSC 小鼠的能力。我们的数据表明，重编程过程中 Oct4 的过表达导致重编程过程中的脱靶基因激活和所得 iPSC 的表观遗传畸变，从而对 iPSC 技术的进一步开发和应用具有重大意义。

背景

自从山中伸弥（Shinya Yamanaka）突破性地发现转录因子 (TF) 驱动的重编程（Takahashi 和 Yamanaka，2006 年）以来，多项研究已经解决了重编程鸡尾酒中每个成分的功能（Li 等人，2010 年；Malik 等人，2019 ；Soufi 等人，2012；Sridharan 等人，2009；Tsankov 等人，2015）。 Yamanaka 实验室的后续工作表明，在重编程混合物中的四种 TF——Oct4、Sox2、Klf4 和 cMyc (OSKM)——中，只有 cMyc 可以省略，同时仍然允许产生诱导多能干细胞 (iPSC) (Nakagawa 等人, 2008)。此外，尽管 Sox2、Kfl4 和 cMyc 可以被其 TF 家族的其他成员取代，但 Oct4 不能被 Oct1 或 Oct6 取代。已经进行了许多尝试来替换重编程混合物的成分，以了解每个因素的分子作用，并可能提高重编程技术的效率和安全性（Radzisheuskaya 和 Silva，2014 年）。

尽管许多研究表明重编程鸡尾酒中 Oct4 的替代可能性（表 S1），但 Oct4 仍然是生成 iPSC 的常用分子。事实上，我们和其他人已经证明，单独的 Oct4 的外源表达足以重编程固有表达其他重编程因子的细胞类型（Kim 等人，2009a，2009b；Tsai 等人，2011；Wu 等人，2011 ）。大多数可以成功重编程为 iPSC 的 Oct4 替代物通过直接激活内源性 Oct4 基因发挥作用（Buganim 等人，2012；Gao 等人，2013b；Heng 等人，2010；Shi 等人，2008） .在体内，Oct4 作为主要调节剂，在维持多能性（Niwa 等人，2000；Pesce 和 Schöler，2001）和在发育过程中建立内细胞团（Nichols 等人，1998）方面发挥着不可或缺的作用。

最近有趣的研究描述了与 Oct4 无关的重编程鸡尾酒，其中 Oct4 被 GATA 因子取代（Montserrat 等人，2013；Shu 等人，2013，2015）。Shu等人假设 Oct4 和 Sox2 可以通过分别抵消彼此在中内胚层和神经外胚层分化中的影响来协调重编程过程中的细胞去分化。该报告表明，与 Oct4 相比，Gata3、Gata4 和 Gata6 等内胚层谱系指定因子促进了更高效率的重编程。此研究介绍了多能性的“跷跷板模型”，将其描述为在诱导相反发育谱系间的精确平衡（Shu and Deng，2013）。

我们团队之前确定 Oct4 对于在小鼠发育过程中建立全能性并不重要。此外，核移植后，Oct4-null 卵母细胞仍然可以有效地将体细胞核重编程为多能性（Wu et al., 2013）。目前的工作是由一个令人惊讶的观察引发的，即不包含 Oct4 的重编程盒能够有效地产生 iPSC，这与长期以来的教条相反。

实验结果

• SKM足够重编程小鼠体细胞多能性

Figure 1. Sox2, Klf4, and cMyc Can Reprogram to Pluripotency in the Absence of Exogenous POU Factor
图1.在没有外源POU因子的情况下，Sox2、Klf4和cMyc可以重新编程为多能性
(A和C)从OKSM(A)和OSKM(C)重编程BOX获得的KSM和SKM多顺反子载体的方案。
(B和D)分别用Teto-KSM(B)和SKM(D)载体产生IPSCs。KSM和SKM IPSCs原代集落和传代克隆系的相差显微镜和荧光显微镜图像(标尺为250 mm)。
(E)分别在KSM和SKM IPSC系中验证Teto-KSM和Teto-SKM转基因，同时确认没有Oct4或Brn4整合。
(F)对MEFs、KSM和SKM iPSC系中Oct4、Nanog和Col1a1启动子中DNA甲基化的亚硫酸氢盐测序分析。
(G)畸胎瘤切片的H&E染色，显示三层胚层(外胚层：角化上皮；中胚层：平滑肌肉；内胚层：立方上皮和呼吸上皮)。
(H)从SKM IPSC系产生的成年嵌合小鼠。
(I)Bright-field和GFP合并的E13的KSM和SKM IPSC嵌合胚胎的性腺图像。
(J)时间进程重编程实验的示意图。
(K)使用多顺反子质粒对Oct4-GFP MEF进行时程重编程实验。103个转导的MEF被放置在饲养层细胞上，并用DOX诱导，持续指定的天数。10dpi计数GFP+集落数。误差条表示SD；n=3。
(L)转导多顺反子载体后MEF的蛋白质印迹分析，1 dpi

最初，我们从广泛使用的 tetO-OKSM 多顺反子重编程盒 (Sommer et al, 2009) 中移除 Oct4生成一个负对照来比较不同 POU 因子的重编程能力（图 1A）。令我们惊讶的是，在 Oct4-GFP 报告小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) (OG2) 中诱导 KSM 仍然可以产生 GFP+ 菌落（图 1B）。

然后，我们也从 tetO-OSKM 质粒中删除了 Oct4（Carey 等人，2009、2010、2011；图 1C）。早在诱导后 5 天（dpi），SKM 盒也产生 GFP+ 和碱性磷酸酶阳性菌落（图 1D 和 S1B）。PCR基因鉴定证实SKM/KSM慢病毒整合到所有IPSC系中，而没有检测到Oct4转基因或另一种POU因子Brn4(图1E)。

KSM/SKM(以下简称SKM)IPSCs具有胚胎干细胞(ESCs)的形态特征，可扩增至少15代(图1B和1D)。多能特异性标记SSEA1和Nanog染色阳性(图S1a)。亚硫酸氢盐处理的DNA的甲基化分析显示，Oct4和Nanog启动子是低甲基化的(图1F)，表明多能性基因的表观遗传激活。相反，在重新编程的细胞系中，Col1a1启动子高度甲基化，表明体细胞基因沉默。SKM IPSCs在畸胎瘤形成分析中产生了所有三个胚层(图1G)，并促进了可存活的嵌合小鼠的发育(图1H)，包括生殖系(图1I)。

SKM重编程与表达载体或起始细胞类型无关

为了评估SKM重编程与OSKM重编程的效率和动力学，我们进行了时间进程重编程实验。用OSKM、SKM、OSK、OKM或OSM多顺反子载体转导OG2 MEF，并用多西环素(DOX)诱导1-8天(图1J)。SKM在诱导至少5天后产生GFP+克隆，与OSKM相比延迟了2天(图1K)。诱导后6-8天的SKM重编程效率约为OSKM的30%。令人惊讶的是，从OSKM中移除Oct4的危害最小，而移除KLF4导致重新编程效率下降最大。Western印迹分析证实了类似的因子表达和没有从每个组合中消除的因子(图1L)。使用具有Gof18；ROSA26-rtTA背景的MEF得到了非常相似的结果(图S1B)。

我们排除了TET诱导启动子或反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)在没有Oct4的情况下启动了重编程的可能性，因为我们证明了EF1a-SKM/KSM在没有rtTA的情况下可以产生GFP+克隆(图S1C)。我们还将KSM克隆到非整合的游离载体中，以尝试无病毒的重编程(Okita等人，2011年)。将游离KSM进行脂质体转染导入MEF产生GFP+克隆，这些克隆扩增成稳定的IPSC系(图S1D)，第五代失去了载体(图S1E)。我们通过免疫染色和畸胎瘤检测证实了无整合KSM-IPSCs的多能性(图S1F和S1G)。

为了解决SKM重新编程是否依赖于特定的起始细胞群体的问题，我们转导了预分选的THY-和Thy+亚群的MEF，发现两者都可以重新编程，尽管在Thy+细胞中诱导SKM可以产生更多的GFP+克隆(图S1H-S1J)。我们还证明了在没有外源Oct4的情况下，成人肺成纤维细胞(图S1K)、永生化的成人尾尖成纤维细胞(图S1L)和皮质星形胶质细胞(图S1M-S1P)可以被重新编程。总体而言，SKM重编程的效率似乎与细胞分裂的速度有关，而与细胞的来源无关。

Oct4缺失时的重新编程依赖于高细胞增殖率

Figure 2. Highly Proliferative Cells Can Be Reprogrammed by Sox2 and Klf4 Alone
图 2. Sox2 和 Klf4 单独可以重新编程高度增殖的细胞
(A) 用分离的 KSM 和 SKM 盒重新编程 Oct4-GFP MEF。通过用三种浓度的 dox 诱导获得不同水平的转基因表达：1 μg/mL (H)； 50 ng/mL (M);和 10 ng/mL（L；参见 tetO-mCherry 面板，右）。在 7 和 14 dpi 后计数 GFP+ 菌落。误差线代表 SD； n = 3;比例尺代表 250 毫米。
(B) 14 dpi 后 Sox1-KM 和 Sox2-KM iPSC 的明场和 Oct4-GFP 合并概览图像（比例尺代表 1 毫米）。
(C) 使用 Sox2KM 或 Sox1-KM 多顺反子盒结合 Oct4、Gata4 或 Gata6 对 Oct4-GFP MEF 进行重新编程。通过用 1 μg/mL 或 50 ng/mL dox 诱导 12 天实现不同水平的转基因表达。在 D14 计数 GFP+ 菌落。误差线代表 SD； n = 3。
(D) 通过异位表达 Sox2Klf4 双顺反子盒结合 Oct4、cMyc、Gata4 或 Gata6 对 SV40LT 永生化 Oct4-GFP MEF 进行重编程。误差线代表 SD； n = 3。使用Student‘s t 检验计算统计显著性。
(E) 细胞增殖试验。在 96 孔板中用指定的构建体转导 MEF。在 0、2、4 和 6 dpi 后收获细胞并计数。 SK样品用作计算统计显着性的对照。误差线代表 SD； n = 3。使用Student‘s t 检验计算统计显著性。

为了进一步了解驱动 SKM 重编程的组件，我们剖析了重编程盒。我们发现 KS 和 SK 都不能单独重新编程，但是当与 Oct4 或 cMyc 结合时，每个都可以产生 GFP+ 菌落（图 2A）。我们使用三种不同浓度的 dox 来诱导不同水平的重编程因子表达。尽管即使是最低表达水平（10 ng/mL dox）也足以进行 OSKM 重编程，但在没有 Oct4 的情况下重编程需要更高水平的表达（50 或 1,000 ng/mL dox）。因子的多顺反子表达似乎对 SKM 重编程有益，但并不重要，因为 SK+M、KS+M、K+SM 甚至 S+K+M 都可以产生 GFP+ 集落，尽管在单顺反子诱导的情况下效率非常低。 Klf4-IRES-Sox2 (KS)+M 可以产生效率与 KSM 相当的 iPSC，不包括可能由未切割的 2A 肽引起的多蛋白获得功能效应的可能性 (Velychko et al, 2019)。

据报道，内胚层特异性 GATA 因子可以替代 Oct4 重编程为多能性，而外胚层特异性 Sox1 或 Sox3 可以替代 Sox2 (Shu et al, 2013, 2015)。我们用 Sox1 替换了 Sox2，观察到 SKM 和 OSKM 鸡尾酒的重编程效率仅降低了 50%（图 2B 和 2C）。添加 Gata4 或 Gata6 并没有显着提高 Sox2-KM 或 Sox1-KM 在高水平转基因表达的重编程效率，但在较低诱导水平下增加了 GFP+ 菌落的数量（图 2C）。

我们接下来测试 Gata4 或 Gata6 是否可以仅与 SK 结合重新编程。事实上，正如 Shu 等人 (2013) 所报道的，SK+Gata4/6 可以生成 iPSC；然而，重编程效率比 SK+O 或 SK+M 低 10 倍（图 S2A 和 S2B）。此外，当用较低的 dox 浓度诱导时，SK+GATA 不会产生任何 GFP+ 菌落（图 S2A）。

鉴于 GATA 因子、Oct4 和 cMyc 共享激活增殖基因的能力，我们接下来怀疑单独的 SK 是否可以重新编程高度增殖的细胞。我们将 tet 诱导型 SV40 大 T 抗原 (SV40LT) 慢病毒载体引入 MEF，使我们能够在重编程过程中可逆地使成纤维细胞永生化（Anastassiadis 等，2010）。起始 MEF 的永生化允许仅使用 SK 重新编程，并导致添加 cMyc、Gata4 或 Gata6 对于提高效率无效（图 2D、S2C 和 S2D）。 SK iPSCs（图 S2E）可以传代至少 12 次，同时保留正常核型（图 S2F）。我们通过 PCR 基因分型验证了它们的基因组整合，并通过免疫染色、畸胎瘤形成和嵌合体贡献（包括生殖系）验证了它们的多能性（图 S2G-S2K）。

通过重编程过程进行的细胞增殖试验表明，添加 Gata4 或 Gata6 显着增加了成纤维细胞的增殖，与单独的 SK 相比，6 dpi 后细胞数量增加了 2 倍（图 2E）。因此，我们得出结论，当与 SK 结合时，GATA 因子可以通过以类似于 cMyc 和 SV40LT 的方式增加增殖率来重新编程成纤维细胞。

SKM iPSC 展现出显著增强的发育潜力

Figure 3. Omitting Oct4 in the Reprogramming Cocktail Increases the Quality of iPSCs
图 3. 在重编程组合中省略 Oct4 可提高 iPSC 的质量
(A) 四倍体互补实验示意图。
(B) 使用 SKM#1 iPSC 细胞系通过四倍体互补测定产生的所有 iPSC 幼崽。将 23 个聚集体转移到 2 个假孕 CD-1（白色）雌性。
(C) 本研究中产生的 4N-on 与 4N-off iPSC 和 ESC 与已发布数据的总比率。
(D) 源自 tetO-OSKM、SKM/KSM iPSC 或 ESC 的 4N 聚集胚胎百分比，这些胚胎产生足月幼崽、开始呼吸的幼崽、在寄养护理中存活至少 48 小时的幼崽以及存活的幼崽的百分比到成年（至少 3 个月）。条形代表所有测试线之间的平均值。统计显著性通过 Mann-Whitney 检验确定。误差线代表 SEM。
(E) 用 SKM#1 iPSC 系通过四倍体互补测定产生的 6 个月大的全 iPSC 小鼠。
(F) 分别对 SKM 和 KSM all-iPSC 小鼠的 F1 后代进行 SKM 或 KSM 转基因的 PCR 基因分型。

接下来，我们通过对多能性最严格的测试——四倍体 (4N) 互补测定进行来评估 SKM iPSC 的发育潜力（图 3A；Nagy 等，1990）。在这种方法中，测试的 iPSC 与 4N 胚胎聚集在一起，这些胚胎可以形成胚胎外组织，但不能形成可行的内细胞团。这种聚集体的发育导致胎儿几乎完全由 iPSC（全 iPSC 小鼠）组成。

我们测试了来自 Gof18-Rosa26-rtTA MEF（5 个 SKM、3 个 KSM 和 5 个 OSKM 系）的 13 个克隆 tet 诱导 iPSC 系，这些系是平行生成和培养的。所有测试的系都经过预选，以最大限度地减少转基因泄漏，以避免可能的有害发育影响（图 S3A）。此外，我们从通过交配 SKM#1 all-iPSC 小鼠获得的 F1 胚胎生成对照 ESC 系，以实现最接近的匹配基因型。所有 SKM iPSC 系都能够产生足月全 iPSC 幼崽（4N-on；图 3B 和3C;表 S2)。相比之下，5 个 OSKM 系中只有 3 个是 4N-on（图 3C），证实了已发表的报告（Amlani 等人，2018；Buganim 等人，2014；Chen 等人，2015）。令人惊讶的是，44.1% ± 9.1% 的 SKM iPSC 和 27.1% ± 17.5% 的 ESC 聚集胚胎产生了完全发育的幼崽，而 OSKM iPSC 的这一比例仅为 2.3% ± 1.4%（图 3D）。

OSKM 系的 4N 互补效率与其他报告的相当（图 S3B），而 SKM iPSCs 的效率远高于 OSKM iPSCs 或由替代鸡尾酒——Oct4+Tet1 (OT) 或 Sall4+Nanog+ Esrrb+Lin28 (SNEL) 产生的 iPSCs——据报道可提高 iPSC 质量（Buganim 等人，2014；Chen 等人，2015；图 3D 和 S3B）。值得注意的是，没有一个 OSKM 全 iPSC 幼崽在寄养护理中幸存（图 S3B），而 49.5% 的 SKM 全 iPSC 幼崽在寄养护理中存活至少 2 天，34% 存活到成年（图 3D）。所有成年 SKM all-iPSC 小鼠均健康且可生育（图 3E 和 3F）。此外，我们测试了 6 个由游离型载体生成的无整合 iPSC 系（图 S1D-S1F）。结果基本一致：所有测试的游离型 KSM (epiKSM) iPSC 系均为 4N-on，而 3 个 EpiKSM+O 系中只有 1 个为 4N-on，尽管质量很高（图 3C；表 S2）。与 tet-诱导系相比，附加型的变异性更高，这是由于游离型质粒消失的随机性，因此缺乏因子表达控制（Okita 等，2013）。尽管如此，高质量的 epiKSM+O 系的出现表明，即使在 Oct4 存在的情况下，某些条件，例如较低的表达、快速的载体消失或特定的 O:KSM 比率，也可以产生高质量的 iPSC。

总之，SKM 鸡尾酒产生的 iPSC 具有极高的发育潜力，比 OSKM 高近 20 倍，这表明外源性 Oct4 对 iPSC 的质量产生不利影响。

Sox2 和 cMyc 的共表达导致成纤维细胞中的逆转录病毒立即沉默

Figure 4. Co-expression of Sox2 and cMyc Leads to Immediate Retroviral Silencing in MEFs
图 4. Sox2 和 cMyc 的共表达导致 MEF 中的逆转录病毒立即沉默
(A) OSKM 和 SKM 重编程期间 pMX-mCherry+ Oct4-GFP MEF 的时间过程 FACS。
(B) 表达 Oct4、Sox2、Klf4、cMyc 的 pMX-mCherry+ MEF 的 FACS 分析，以及克隆到 tet 诱导型多顺反子载体中的因子组合，其中 IRES-Puro 在 D3 诱导和嘌呤霉素选择。
(C) 实验设计以跟踪使用 OSKM 或 SKM 以 3 dpi 进行逆转录病毒沉默或未经历逆转录病毒沉默的细胞的命运。
(D) 使用 OSKM 或 SKM 对 pMX-mCherry+ Oct4-GFP MEF 进行重新编程。细胞在 3 dpi 后被分选为 mCherry，并铺在饲养层上。在 7 和 14 dpi 后计数 GFP+ 菌落。误差线代表 SD； n = 3。使用学生 t 检验计算统计显着性。
(E) 时程 SKM 与 OSKM 重编程 RNA-seq 实验的实验设计。
(F) 热图显示基于 RNA-seq 数据的时程重编程样本之间的 Spearman 相关系数。
(G) 描述 OSKM 或 SKM 诱导后基因表达的相对倍数变化 (FC) 的热图。所选基因被报告为系统性 siRNA 筛选中的前 100 个命中，用于在多能干细胞中重新激活逆转录病毒（Yang 等，2015）。层次聚类基于欧几里得距离。

我们假设基于莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）的载体的早期沉默可能解释了许多出版物中提出的矛盾数据，这些出版物报道了山中鸡尾酒中 Oct4 的必要性（表 S1）。人们普遍认为，逆转录病毒转基因的沉默是多能细胞而非体细胞的一个显着特征（Hochedlinger 和 Plath，2009）。

我们用表达 mCherry 的逆转录病毒 pMX 载体转导 OG2 MEF，以跟踪重编程过程中的逆转录病毒沉默。令人惊讶的是，SKM 和 OSKM 诱导的成纤维细胞的形态变化与早在 2 dpi 开始的 mCherry 信号丢失相吻合（图 4A、S4A 和 S4B）。后来，mCherry-细胞形成圆顶状菌落，其中出现 Oct4-GFP+ 细胞（图 4A 和 S4B）。我们量化了 OSKM 和 SKM 重编程期间的时间过程荧光激活细胞分选 (FACS) 分析的结果（图 S4C）。虽然一半的成纤维细胞在 2 dpi 后已经失去 mCherry 表达，但三分之一的 mCherry+ 细胞仍表达成纤维细胞特异性 Thy1，但大多数在 4 dpi 时变为双阴性。这些数据表明，逆转录病毒沉默在慢病毒驱动的重编程过程中很早就发生了——甚至在体细胞身份丧失之前。

如果这种立即沉默发生在逆转录病毒介导的重编程过程中，它将阻止成纤维细胞转化为 iPSC。事实上，当 pMX-mCherry+ 细胞被逆转录病毒 Oct4、Sox2、Klf4 和 cMyc 感染时，一些细胞组失去了 mCherry 表达并停止了重编程（图 S4D）。 GFP+ 细胞只能从不断表达转基因的 mCherry+ 簇中产生。因此，使用基于 MMLV 的载体重编程会选择不经历早期逆转录病毒沉默的细胞。

我们分解了 tetO-OSKM 盒，以确定驱动早期逆转录病毒沉默的确切因素。我们将重编程因子克隆到携带 IRES-Puro 的 tet 诱导型载体中，从而可以选择受感染的细胞。虽然单独诱导时没有任何因素可以触发沉默，但 Sox2 和 cMyc (SM) 的同时表达足以在 3 dpi将大多数细胞中的逆转录病毒转基因沉默（图 4B）。

我们追踪了经历或未经历早期逆转录病毒沉默的细胞的重编程命运。我们在 SKM 或 OSKM 诱导和选择后对 d3 的细胞进行分类，并将细胞种在饲养层上以评估它们的重编程命运（图 4C）。总的来说，mCherry-对于两种重编程条件，种群产生的 GFP+ 菌落数量明显高于 mCherry+ 种群。虽然在 OSKM 重新编程的情况下，相同数量的 mCherry-细胞产生的 GFP+ 菌落是 mCherry+ 细胞的 4 倍，在 SKM 的情况下，mCherry-的菌落比 mCherry+ 多近 50 倍（图 4D）。因此，我们证实逆转录病毒沉默发生在重编程的早期，这与 SKM 诱导特别相关。总之，这些结果表明逆转录病毒驱动的 SKM 重编程不可行（图 S1C）。

重新编程 48 小时后逆转录病毒沉默机制已经建立

为了更深入地了解 SKM 重编程的机制，我们在重编程过程中进行了 RNA 测序（RNA-seq）（图 4E）。 pMX-mCherry+ OG2 MEF 用多顺反子 SKM 或 OSKM 转导；在 2、4、6、9 和 12 dpi 后收集样本。只有mCherry-细胞用于 RNA 分离以减少异质性并消除未转导细胞的污染。此外，我们对在第 6 天（mCherry-/GFP-/Epcam+）或在第 9 天和第 12 天（dox 戒断后 2 天）经历间充质到上皮转化 (MET) 或激活内源性 Oct4 (mCherry-/GFP+) 的重编程中间体亚群进行了测序；图S4E)。以 Spearman 相关性作为距离度量的全局层次聚类显示 iPSC 和 d12 样本聚集在 ESC 附近，远离起始 MEF，而 d2-d9 样本聚集在两者之间（图 4F）。

此前，Yang 等人 (2015) 进行了全基因组小干扰 RNA (siRNA) 筛选，揭示了在多能干细胞中介导逆转录病毒沉默的成分。我们分析了样本中与逆转录病毒沉默有关的前 100 个基因的表达。值得注意的是，通过 SKM 或 OSKM 诱导的 d2，该基因子集的表达已经与 ESC 的表达相似（图 4G）。在 d2 上调的基因中有逆转录病毒沉默的关键驱动因素：组蛋白伴侣（Chaf1a/b 和 Smarcc1）、SUMO 化因子（Sumo2、Ube2i、Sae1、Uba2 和 Ube2j2）和染色质修饰者（Trim28、Setdb1 和Mphosph8)。因此，我们得出结论，多能细胞中逆转录病毒阻遏物机制在 SKM 或 OSKM 诱导的 2 天左右，可以在成纤维细胞中建立。

在体细胞中启动多能性程序不需要 Oct4

Figure 5. SKM Can Activate Pluripotency Program in Oct4-KO MEFs
图 5. SKM 可以激活 Oct4-KO MEF 中的多能性程序
（A 和 B）在 OSKM 和 SKM 重编程期间指示的成纤维细胞（A）和 MET（B）基因的时程表达图。对于 d6 和 d9，仅显示 Epcam+ 和 GFP+ 分类样本，分别。
(C) MEF 和 ESC 特异性基因的时程表达 (Chronis et al, 2017)。仅绘制了具有 FC >=4 的差异表达基因 (DEG)。
(D) OSKM 和 SKM 重编程期间指示基因的时间过程表达图。
(E) Oct4、Nanog (ChIP-Atlas) 和 Sall4 (Lim et al, 2008) 目标在 ESC 中的时程表达。仅绘制了 5 kb DEG（iPSC 与 MEF 中的 FC >=4）内的顶峰（macs 得分 >= 200，在 Chip-Atlas 上）。
(F) qPCR 基因表达分析 Nr5a2、Nanog 和 Sall4 后短发夹 RNA (shRNA) 驱动 KD 在 2 dpi 后用 OSKM 重编程期间。 ActB 用作参考基因。误差线代表 SD； n = 3。
(G) 重编程 Oct4-GFP MEFs，表达 Nr5a2、Nanog、Sall4，或用 OSKM 或 SKM 控制 shRNA。在 7 和 14 dpi 后计数 GFP+ 菌落。误差线代表 SD； n = 3。使用student' t 检验计算统计显着性。
(H) 生成 Pou5f1 (Oct4)-KO MEF 的策略。
(I) PCR 基因分型确认 3 个 MEF 系中 Oct4 的纯合缺失。
(J) 7 dpi 上用 SKM 重新编程的 Oct4F/F 和 Oct4D/D MEF 的免疫荧光成像。
(K) Epcam+ Oct4F/F 和 Oct4D/D MEF 在 7 dpi 上用 OSKM 或 SKM 重编程的 qPCR 基因表达分析。误差线代表 SD； n = 3

为了比较 SKM 和 OSKM 重编程的分子路线图，我们分析了与已建立的重编程阶段相关的基因表达：成纤维细胞身份丧失；MET；和多能性的成熟（Li et al, 2010; Polo et al, 2012; Stadtfeld et al, 2008）。 RNA-seq 数据显示，成纤维细胞特异性基因（Snai1、Thy1、Ncam1 等）的下调早在 OSKM 或 SKM 表达的 d2 开始，并且在两种情况下同步进展（图 5A 和 5C）。因此，成纤维细胞特性的丧失似乎与外源性 Oct4 表达无关。 MET 发生在 OSKM 的 d2-d4 和 SKM 重编程的 d2-d6 上，从上皮标志物的上调可以看出（例如，Cdh1、Epcam 和 Esrp1；图 5B）。在没有 Oct4 的情况下部分延迟的 MET 与我们的 FACS 数据一致，显示 SKM 与 OSKM 相比，6 dpi 上的 Epcam+ 细胞较少（图 S4E）。

重编程的成熟阶段，以多能特异性基因的上调为标志，在很大程度上延迟了 SKM 重编程（图 5C）。表达式图证实 SKM 中不存在 Oct4，并且 SKM 与 OSKM 样本中的 Sox2 水平相似（图 5D）。尽管某些基因（例如，Lin28a、Nr5a2 和 Ccnb1）在两种情况下都具有可比的动力学上调，但其他基因在没有 Oct4 的情况下被延迟（例如，Nanog、Tfcp2l1 和 Esrrb）。 Oct4 直接目标的激活（图 5E），例如 Fut9（SSEA1）和 Utf1（图 5D），在 SKM 与 OSKM 重编程中延迟时间最长，而 Nanog 和 Sall4 目标显示的延迟动力学较少（图 5E）。

为了了解内源性Oct4在SKM重编程过程中是如何被激活的，我们用3个候选因子Nr5a2、Nanog和Sall4(图5F)进行了基因敲除(KD)实验，根据RNA-seq数据，这些实验显示相对较早的上调。这三个因素以前都被报道为重新编程中的Oct4替代品(Buganim等人，2012年；Heng等人，2010年)。Nr5a2 KD不影响SKM重新编程的效率(图5G)。另一方面，Nanog或Sall4 KD显著减少了SKM iPSC集落的数量，但对OSKM重新编程的影响要小得多。时间历程免疫染色证实，在重新编程过程中，SKM在Oct4之前激活了Nanog(图S5A)。

结合KD实验的基因图谱表明，Nanog和Sall4是SKM重编程过程中第一个被激活的多能性调节子，尽管内源性Oct4在第二次激活波中上调。为了进一步了解内源性Oct4在SKM重编程中的作用，我们制备了Oct4敲除(KO)成纤维细胞(图5H)。取Oct4flox/flox；Rosa26-CreERT2小鼠的MEF用他莫昔芬处理，并用Teto-SV40LT永生化。选择克隆性MEF以确保Oct4等位基因的纯合缺失(图5I)。免疫组织化学染色显示，在Oct4完全缺失的情况下，SKM的诱导可激活Nanog和Sall4(图5J)。7dpi后对Epcam+细胞的qPCR分析表明，SKM可以下调Oct4-KO MEF中成纤维细胞特异性基因(Thy1和slug)，并激活Met(Epcam和CDh1)和多能性基因(Nanog、Sall4、Lin28和Tfcp2l1)(图5K)。然而，一些晚期多能性基因(如Esrrb和REx1)仅部分上调，Oct4-KO 的SKM 前-IPSCs时期进行DOX戒断不能存活，这表明Oct4仍然需要完成多能性的建立和维持。

Oct4 过表达使细胞从直接途径转向多能性

为了比较 OSKM 和 SKM 重编程期间发生的全局基因表达变化，我们进行了二维降维方法：主成分分析 (PCA) 和 t 分布随机邻居嵌入 (t-SNE)分析（图 6A、6B 和 S6A）。如前所述（Polo 等人，2012），PCA 表明 OSKM 重编程细胞在 PC2 维度中从直接途径暂时转向 d6、d9 和 d12 上的多能性，甚至在 PC3 维度中部分重新获得 MEF 身份（图6A 和 S6A)。相比之下，SKM 重编程沿着更直接的 PC2 轨迹发生，并进一步从 PC3 中的 MEF 转移。 t-SNE 分析显示 SKM 和 OSKM 样本之间的区别更加明显，从 4 dpi 开始。

据报道，成纤维细胞中的 SKM 诱导导致外胚层基因表达升高，这可以被 Oct4 或 GATA 因子抵消，从而导致多能性诱导（Shu 等，2013）。然而，其他研究表明，OSKM 重编程也会导致外胚层基因的瞬时升高（Gonza´ lez 和 Huangfu，2016；Mikkelsen 等，2008）。我们比较了 SKM 与 OSKM 重编程对外胚层、中胚层和内胚层基因表达的影响。中胚层基因在 OSKM 或 SKM 诱导后迅速下调（例如，Snai1、Snai2 和 Chrd），这与成纤维细胞身份的丧失相吻合（图 6C）。

内胚层基因在整个重编程过程中基本上不受影响；然而，与 Shu 等人 (2013) 的报告相比，许多外胚层基因在 SKM 和 OSKM 重编程过程中都会瞬时上调。此外，OSKM 引起更强的外胚层诱导（例如，Krt1、Evpl 和 Nes），