作者，Evil Genius
其实我们每个人都会遇到逆境，无论是失业、失恋，还是各种不顺，我们唯一可以依靠的只有自己。
还是那句话，WES + 单细胞是最经济的多组学方案。
今天我们分享文献
知识积累
胆囊癌（GBC）是最具侵袭性的胆道恶性肿瘤，死亡率极高。由于驱动肿瘤进展的局部肿瘤微环境中原位驱动因子的隐匿性，GBC治疗面临重大挑战。
研究聚焦于肿瘤发生过程中癌细胞的内在改变，如基因突变和异常表达，这些改变可促进肿瘤生长和免疫逃逸。例如，ERBB2/ERBB3突变肿瘤中MDK表达上调，通过与LRP1相互作用驱动免疫抑制性巨噬细胞分化并增强调节性T细胞浸润；而肿瘤细胞中OLFM4的升高可通过MAPK–AP1信号轴上调PD-L1表达。然而，肿瘤免疫微环境（TIME）的演化规律，以及肿瘤与TIME间空间互作的动态特征仍不清楚。
单细胞 + WES + Spatial（CODEX）。
在腺癌患者中鉴定出五种具有显著临床预后差异的局部肿瘤微环境（TME）。
结果1、胆囊癌全景单细胞图谱研究
肿瘤微环境（TME）和肿瘤免疫微环境（TIME）在不同样本间均呈现显著的细胞组成异质性。
胆囊癌突变图谱
通过inferCNV鉴定的恶性上皮细胞。
全外显子测序（WES）分析共鉴定出5,989个非同义突变和2,633个同义突变，其中TP53、CDKN2、ACOT12、E2F8、JUN和HRC等6个基因呈现显著突变。
不同TNM分期和肿瘤部位的突变负荷无显著差异。
构建了两种系统发育树：（1）基于WES数据的单核苷酸变异和插入缺失（indel），使用Pairtree构建克隆水平系统发育树；（2）基于MEDICC2分析体细胞拷贝数变异构建的拷贝数水平系统发育树。所有患者均呈现分支进化的系统发育模式及多克隆共存特征。
结果2、巨噬细胞介导的中性粒细胞富集促转移微环境（P_Mets）
在对144,893个单核细胞/巨噬细胞和120,380个中性粒细胞进行聚类分析，并通过熵值筛选常见亚型后，分别从9个和12个潜在亚型中鉴定出7个和5个稳定存在的常见亚型。
通过差异表达基因（DEG）分析、SCENIC调控网络推断、基因特征评分及Ro/e细胞富集分析，鉴定出功能各异的细胞亚型及其在不同组织学类型中的差异化富集模式。通过Monocle进行的拟时序分析显示，N_C0_MNDA和N_C7_MNDA_S100A8是最早被募集的中性粒细胞亚型。
基于胆囊癌（GBC）组织学分类的异质性，研究聚焦于最常见的腺癌类型（Adeno）。重点探究了两个关键问题：首先，为解析肿瘤发生相关的局部微环境改变，比较了腺癌原发灶组（Adeno_Pri）与非肿瘤组（包括CC_GB、XGC_GB、LG_GB和HG_GB）的微环境组成。其次，为探究转移相关的局部肿瘤微环境（TME）变化，根据临床诊断将Adeno_Pri分为局限性腺癌组（P）和转移性腺癌组（P_Mets），并比较其微环境差异。分析发现，巨噬细胞和中性粒细胞亚型在疾病进展过程中均呈现动态变化。值得注意的是，几乎所有常见中性粒细胞亚型在P_Mets组均显著增加，提示存在一种富含中性粒细胞的促转移性TME。
鉴于N_C0_MNDA和N_C7_MNDA_S100A8是肿瘤相关中性粒细胞（TANs）的起源亚型，采用CellChat进行细胞互作分析以揭示中性粒细胞募集的关键调控者。结果显示，多个巨噬细胞亚型参与中性粒细胞招募，这些巨噬细胞亚型（尤其是M_C0_FOLR2和M_C2_SPP1）中趋化因子基因显著上调。
细胞互作结果与CODEX检测的空间共定位现象高度吻合。
巨噬细胞可能通过募集早期浸润的中性粒细胞亚型（N_C0_MNDA和N_C7_MNDA_S100A8），这些细胞在TME诱导下分化为TAN亚型，最终形成富含TAN的促转移性腺癌微环境。其中，N_C7_MNDA_S100A8作为NETs形成相关亚型，与患者不良预后显著相关。
结果3、转移性腺癌富集的促肿瘤树突状细胞亚型（P_Mets）
通过对13,571个树突状细胞（DCs）进行分群，鉴定出8个细胞cluster，其中7个常见细胞cluster用于后续分析。在表征DC亚型后，比较分析显示大多数DC亚型在Adeno_Pri组中减少，这一发现在配对样本的独立队列中得到验证。值得注意的是，DC_C4_PPP1R14A_cDC2亚型在P_Mets组中显著富集。
通过拟时序分析、SCENIC调控网络分析和标志物表达检测，发现DC_C4_PPP1R14A_cDC2代表cDC2中具有脂质抗原呈递功能的亚群。其标志物CD1A的表达水平随疾病进展显著升高，表明该细胞的生成与疾病恶化相关。这一结论也与既往研究一致：CD1A+ DCs的浸润与喉癌不良预后相关。细胞互作分析显示，DC_C4_PPP1R14A_cDC2通过ANXA1–FPR1信号通路与髓系亚型（尤其是M_C1_S100A8）发生互作，该通路在细胞募集过程中起关键作用。CODEX空间分析证实这两个亚型存在空间共定位，提示DC_C4_PPP1R14A_cDC2可能通过ANXA1–FPR1招募M_C1_S100A8。
这些结果表明：DC_C4_PPP1R14A_cDC2作为脂质抗原呈递细胞，代表GBC中一类恶性cDC2亚型。更重要的是，首次揭示该亚型可能通过ANXA1–FPR1通路招募M_C1_S100A8，并在P_Mets微环境中与其他髓系细胞形成强效互作网络。
结果4、P_Mets组富集的胆道相关AREG+初始CD4+ T细胞
在淋巴样细胞亚型分析中，通过对CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）、B细胞和浆细胞进行聚类，并基于熵值筛选后，分别鉴定出10个、8个、8个、5个和2个常见亚型。在明确各亚型功能与分布特征后，重点解析了从非癌状态到癌变过程中亚型功能与比例的显著变化。值得注意的是，在Adeno_Pri组富集的CD8T_C1_CXCL13_TEX亚型，在疾病早期阶段虽表现出增强的细胞毒性和免疫检查点活性，但从IIIB期到IVB期其细胞毒性逐渐减弱，提示晚期疾病中该亚型向耗竭状态转变。细胞互作分析和CODEX空间检测证实，这一功能转变可能通过CD86–CTLA4通路与M_C1_S100A8的相互作用所调控。
在P_Mets富集亚型中，鉴定出具有高表达AREG特征的CD4T_C2_CCR7_TN亚型。值得注意的是，该亚型具有胆道组织微环境特异性，并可能通过分泌IL-10调控肿瘤微环境。
结果5、P_Mets组富集的促血管生成基质细胞亚型
P_Mets中富集的F_C1_CFD_iCAF与EC_C3_GJA5_Artery可能通过VEGFB-FLT1信号轴相互作用促进血管生成。两种亚型的富集均预示不良临床预后，进一步佐证了其促血管生成特性。
结果6、腺癌微环境分型
为探究肿瘤基因突变诱导的微环境重塑变化，总结了在特定突变组中显著富集的细胞亚型。研究发现，MUC5B突变可导致多个亚型显著富集，包括CD8T_C0_CCR7_GZMK_TCM、CD4T_C7_ISG15和CD4T_C2_CCR7_TN，提示微环境中细胞组成的改变可能与患者遗传背景相关。
基于疾病进展过程中显著变化的亚型，对腺癌患者进行聚类分析，最终鉴定出五种局部微环境类型（MI1-MI5）。在表征各微环境特异的细胞共现模式后，预后分析显示晚期样本富集的MI2型与不良临床结局显著相关。为验证该分型体系，通过CIBERSORTx算法解卷积外部RNA-seq数据并估算细胞比例，根据估算结果为患者微环境分型，再次证实MI2型患者预后较差。进一步分析显示，MI2特异的细胞亚型（CD8T_C0_CCR7_GZMK_TCM、CD8T_C12_TRDC_γδT和CD4T_C2_CCR7_TN）均显著富集。
综上，研究基于显著变化的细胞组分构建了五种微环境分型。其中MI2型在内部队列和外部队列中均显示不良预后。虽然MI2与MI5均为淋巴细胞相关微环境，但二者临床结局迥异，表明MI2中独特的淋巴细胞亚型可能是其预后特征的关键决定因素。
结果7、肿瘤微环境（TME）互作的空间特征
AI-EPI方法成功鉴定了肿瘤细胞基因模块，并识别出恶性亚型GM16。该亚型具有以下特征：(1)与上皮-间质转化相关；(2)在P_Mets中富集；(3)与肿瘤内异质性正相关；(4)导致不良临床结局；(5)与恶性TIME亚型空间共定位。
结果8、P_Mets近端富集亚型中AREG驱动转移的分子机制
AREG仅表达于靠近GM16的细胞亚型（包括CD8T_C0_CCR7_GZMK_TCM、CD4T_C2_CCR7_TN、DC_C4_PPP1R14A_cDC2、M_C1_S100A8和B_C0_IGHA1），而在远离GM16的内皮细胞、成纤维细胞及中性粒细胞亚型中不表达。通过多重免疫组化验证，发现AREG不仅在巨噬细胞、B细胞和T细胞中表达，还存在于上皮细胞。由此推测，这些聚集的恶性微环境亚型产生的AREG可能在胆囊癌中发挥促瘤作用。
尽管既往研究证实AREG在其他癌种中促进肿瘤增殖和转移，但其在胆囊癌发生发展中的作用尚不明确。CCK8实验显示，AREG处理对人胆囊腺癌细胞系GBC-SD的增殖速率无显著影响。但与其它癌种研究一致，迁移和侵袭实验证实AREG能显著促进肿瘤细胞转移。这些结果表明，AREG可特异性促进胆囊癌的转移进程。
AREG通过EGFR–pERK–EGR1信号通路上调肿瘤细胞CXCL5表达
AREG–CXCL5轴招募中性粒细胞导致免疫治疗耐药
采用分化HL-60细胞的体外实验证实，CXCL5可显著增强中性粒细胞趋化迁移。在人源化小鼠脾内注射模型中，AREG预处理的GBC-SD细胞可诱导肿瘤内CD66b+中性粒细胞浸润增加。
为探究中性粒细胞浸润对免疫治疗的影响，抗PD-L1治疗显示：未接受AREG处理的组别疗效更佳，肝脏/体重比下降更显著。免疫组化证实AREG处理组中性粒细胞浸润更多，SGC996模型重复验证该现象。
综上，恶性TIME亚型与肿瘤细胞形成空间聚集并高表达AREG。在AREG刺激下，肿瘤细胞不仅易发生转移，还通过EGFR–pERK–EGR1信号通路上调CXCL5，从而增强中性粒细胞浸润并导致免疫治疗耐药。
最后，来看看方法
空间数据分析
