Temporal single-cell tracing reveals clonal revival and expansion of precursor exhausted T cells during anti-PD-1 therapy in lung cancer.png

本文是北大张泽民教授团队2022年的新作，通过T细胞谱系追踪的方式，探究PD-1疗法对于肺癌中免疫微环境的影响。

背景

• 免疫检查点抑制剂通过阻滞T细胞的共抑制信号，并且介导了肿瘤免疫中显著的模式转换；
• 但在实际中，免疫检查点抑制剂只在一小部分肺癌患者中起效，因此，现有的免疫疗法仍然需要进一步升级；
• 之前的研究中，已经报道了PD-1能够逆转处于耗竭状态的Texp细胞；
• 之前的研究表明，由于肿瘤抗原的持续刺激，肿瘤特异性的CD8 T细胞会同时高表达T细胞杀伤和“耗竭”相关基因，而非肿瘤特异性CD8+T细胞则不会表达“耗竭性的相关基因”；
• 有研究提示，Tex细胞表观稳定性很难被进一步改变，从而限制了T细胞发挥功能；
• 最近有研究提示，是那些刚浸润肿瘤组织的免疫细胞发挥着功能，而不是已经存在的细胞发挥功能

结果

1.T细胞可以进一步分为CD8+T细胞，Treg细胞

• 本文中采用了5’端转录组建库以及T细胞受体序列建库的方法，对47块肿瘤活检组织（33快未接受治疗，8份对免疫治疗有响应，5份对肿瘤治疗无响应）进行测序；

• 通过α和β链配对的数据，将T细胞进一步分为43713个克隆亚群，能够追踪克隆谱系并测量治疗后的克隆扩增；

  
  
  Figure 1.png
• 治疗后，能够发现FOXP3+调节性T细胞比例的上升，并且在对治疗抵抗的组中，上升的幅度也更为显著；
• TNFRSF9是一种公认的Treg激活的标志，通过这个标记对Treg进行分群之后，可以看到治疗前和未响应组都存在TNFRSF9调节性T细胞的上升；并且伴随着一些免疫抑制功能的基因的表达上调（IL1R2、REL和LAYN）；TNFRSF9+Treg的富集常常与较差的肿瘤预后相关；
• 对免疫反应有响应的组，最后都有更高程度的CD8+T细胞的浸润，为了进一步探究免疫治疗对CD8+T细胞的影响，将T细胞分为耗竭型CD8+，未耗竭型CD8+，增殖性CD8+；耗竭型的T细胞会高表达一些耗竭型的marker，例如PDCD1，CTLA4，HAVCR；有证据表明，耗竭型T细胞一般起源于肿瘤特异性的T细胞，但是急性感染一般不导致T细胞耗竭；耗竭型T细胞可以作为一种肿瘤反应性T细胞的代理；

• 肿瘤抗原呈递功能的相关基因一般会在耗竭型T细胞中高表达（ENTPD1，ITGAE）等；

  
  
  Figure 2.png
• 对耗竭T细胞进行效应型分子的富集分析，可以看到在终末耗竭型细胞中，对免疫治疗有反应的耗竭型T细胞，会高表达一些效应功能的基因；

2.耗竭型T细胞在肿瘤组织中的前体形式

• 将CD8+T细胞分成与耗竭CD8+T细胞具有共同的TCR序列的以及不具有的两类，在与终末耗竭T细胞具有同样的克隆类型的类群中，除了终末耗竭型以及增殖型，还存在两类未耗竭的（GZMK+NR4A2-和GZMK+NR4A2+）这两类。两种亚型都具有GZMK信号的上调以及共抑制信号的下调；细胞循环的一些标记基因显示GZMK+NR4A2-到GZMK+NR4A2+的发展趋势中，循环的倾向下降，但是组织驻留的潜能则上升；
• 在之前的数据库中，也可以GZMK+NR4A2+/-这两类细胞群具有转化为耗竭型T细胞的潜能；

3.CXCL13在耗竭型T细胞中的表达情况

• CXCL13在Tex和Texp中具有特异性的分布，CXCL13介导能够介导免疫细胞的招募；

• CXCL13只有在CD8+T细胞处于免疫微环境中才会发生表达上调，并且伴随着TCR的激活以及TGF-β信号通路，提示CXCL13的表达上调是处于T细胞耗竭的功能轴上；

  
  
  Figure 3.png

4.Texp细胞在有响应的肿瘤组织中的富集

• 研究发现，Tex细胞相比Tex不相关细胞有更高的组织扩散能力，从而验证了Tex在肿瘤组织中特异分布的结论，提示Tex是主要能够响应PD-1疗法的细胞；

• CXCL13在另外两种肿瘤中的分布未被观察到，可能是由于其他两类肿瘤中的免疫抑制微环境，因此，在不同的癌种中，耗竭型T细胞对免疫检查点抑制剂的反应也是不同的；

  
  
  Figure 4.png

5.原先存在的Texp细胞局部的扩散行为

• 对于这些对PD-1治疗有响应的Texp细胞最先的起源，存在几种不同的假说：(1) 是在接受PD-1治疗之后，由Tex恢复对肿瘤抗原的敏感性；(2) 是由原先就存在的Texp细胞局部扩散而来的；(3) 是由外周的循环T细胞补充而来的；
• 针对第一个假说，已经有文献证明，耗竭型的T细胞具有显著的表观遗传改变，其表型较为稳定，并且RNA速率分析可以看到明显的Tex→Texp的轨迹；

• 作者又进一步探究了原位的Texp是否可以发生扩散，确实可以在治疗前的肿瘤组织中找到一群在对免疫治疗存在响应的肿瘤中存在的Texp克隆亚群（Fig. 5a），并且在数量上会出现扩增

  
  
  Figure 5.png

6.肿瘤特异性T细胞的“克隆复兴”

• 在对免疫治疗有反应的组织中，可以发现一群未在原先肿瘤中出现过的Texp，提示可能是从血液中新招募的；

  
  
  Figure 6.png

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