引言

近年来，尽管人类基因组计划与AlphaFold等结构预测工具极大地丰富了我们对蛋白质序列与折叠的认知，但针对膜蛋白的原位功能研究与配体开发仍面临显著的方法学瓶颈。膜蛋白占据了现有药物靶点的60%以上，然而，针对这一类蛋白获取高特异性、高亲和力的分子探针（特别是针对天然构象、低丰度及多亚基复合物）依然极具挑战。

2026年开年，Science杂志发表了中国科学院杭州医学研究所谭蔚泓院士与吴琴研究员团队的突破性成果 —— SPARK-seq。该研究建立了一种整合CRISPR基因扰动、单细胞多组学测序与核酸适体筛选的高通量平台，首次实现了在单细胞分辨率下，对天然细胞语境中“基因型-表型-配体”互作关系的直接解码。

今天就带一起大家从方法学机制、解决的关键科学问题及“适体组学”的战略意义三个维度，对该技术进行深入剖析，看看这项技术如何突破膜蛋白原位功能研究的困局。

01 方法学突破：从“相关性筛选”迈向“因果性确证”

SPARK-seq的核心创新在于重构了靶点发现的底层逻辑，将传统的“先筛选后鉴定”转变为基于遗传学扰动的“多重并行确证”。

▶ 技术逻辑拆解：

① 多重遗传扰动：研究构建了针对多个膜蛋白的CRISPR-Cas9敲除文库，该步骤在细胞池层面引入了明确的基因型差异。

② 原位文库孵育：利用经过初步富集（仅需4轮）的适体文库与上述细胞池孵育。随后，适体作为分子探针，在天然细胞表面寻找其特异性结合位点，进行配体结合维度的输入。

③ 单细胞多组学读取：利用微流控单细胞测序平台，同步捕获每个细胞的三重信息：

gRNA序列：指示该细胞特定的基因敲除事件。

mRNA转录组：评估基因敲除对细胞转录状态及靶蛋白表达水平的影响（表型确认）。

适体序列：定量记录结合于该细胞表面的适体种类与丰度。

▶ 数据推断模型：

SPARK-seq不依赖生化亲和纯化，而是建立在统计学因果推断之上：若某类适体在特定基因（如Gene X）敲除的细胞群中，其测序读数相较于对照组显著下降，则判定Gene X为该适体的靶点。这种方法直接在活细胞层面建立了靶点与配体的对应关系，规避了非特异性吸附和体外纯化带来的系统误差。

02 性能对标：SPARK-seq的多维优势

与现有的主流蛋白质互作研究技术相比，SPARK-seq在筛选通量、灵敏度及信息维度上实现了质的飞跃。

03 解决的关键科学问题：案例解析

SPARK-seq的价值不仅在于技术参数的提升，更在于其解决具体生物学难题的能力。研究团队在文中展示了该技术在处理同源蛋白区分、低丰度靶点捕获及蛋白复合物识别等方面的独特优势。

▶ 同源蛋白的精准区分：NRP1与NRP2

① 科学问题：神经纤毛蛋白（NRP）家族的NRP1和NRP2在结构上高度相似，且共享部分配体（如VEGFs），但在血管生成与淋巴管生成中行使截然不同的功能。传统探针往往难以实现对二者的绝对区分。

② SPARK-seq解决方案：

研究通过SPARK-seq及配套算法SPARTA，成功鉴定出两类具有正交特异性的适体家族：

NRP1特异性组：仅结合NRP1，且能竞争性阻断VEGF165，提示其结合位点位于经典的配体结合域。

NRP2特异性组：仅结合NRP2，不结合NRP1，且结合位点位于非经典的隐蔽表位。

③ 意义：证明了该技术能够识别蛋白质表面细微的结构差异，为研究特定亚型在肿瘤微环境中的差异化功能提供了精细化工具。

▶ “不可药向”靶点的广谱与特异性识别：PTPR家族

① 科学问题：受体型蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPRs）因其催化结构域高度保守及细胞表面表达丰度极低（部分<1000拷贝/细胞），长期被视为“不可成药”靶点。

② SPARK-seq 解决方案：

灵敏度验证：成功捕获了针对极丰度靶点PTPRD的结合信号。

表位作图能力：发现某类适体能同时结合PTPRD、PTPRF和PTPRS三个高度同源蛋白，表明其识别的是PTPR家族胞外域的保守结构表位。

③ 意义：展示了该平台既能筛选“亚型特异性”探针，也能筛选“家族广谱性”探针，为开发针对整个蛋白家族的通用调控剂提供了可能。

▶ 蛋白质复合物的依赖性识别：ITGA3/ITGB1

① 科学问题：许多膜蛋白（如整合素）必须以异二聚体形式存在才能维持结构稳定并发挥功能。体外纯化的单亚基往往丢失了复合物界面的构象信息。

② SPARK-seq解决方案：数据显示，针对ITGA3筛选的适体，在ITGB1敲除的细胞中信号同样消失。这并非脱靶，而是揭示了ITGA3对ITGB1伴侣效应的依赖性 —— ITGB1缺失导致ITGA3无法正确折叠或定位至膜表面。

③ 意义：证实SPARK-seq筛选出的适体识别的是天然、具有生理活性的蛋白质复合物，而非孤立肽段，这对于开发针对蛋白-蛋白互作（PPI）界面的药物至关重要。

04 动力学筛选优势：慢解离速率的天然选择

在药物研发中，药物-靶点复合物的停留时间被认为是预测体内疗效的关键指标。

SPARK-seq的实验流程包含多轮微流控液滴包被与洗涤步骤，这一过程构成了天然的动力学筛选压力。数据分析表明，SPARK-seq计算出的差异结合倍数与适体的解离速率呈现显著正相关，而与平衡解离常数的相关性较弱。

这一特性使得SPARK-seq能够优先富集那些紧密结合、不易脱落的适体分子，直接筛选出具有长效潜力的候选药物分子，省去了后续繁琐的动力学优化环节。

05 SPARTA算法：数据驱动的理性设计

配合SPARK-seq产生的高维数据，研究团队开发了SPARTA算法框架。

该框架整合了深度学习模型：

① 判别模型：在预测适体与PTK7的结合能力上达到了约97%的准确率。

② 生成模型：利用变分自编码器（VAE）生成了文库中未覆盖的全新序列。实验证实，这些AI生成的变体不仅保留了结合活性，部分序列在解离动力学上甚至优于亲本序列。

这标志着适体开发正从“随机筛选”向“AI辅助理性设计”的模式演进。

06 展望：“适体组学”—— 连接基因型与表型的分子桥梁

基于上述突破，谭蔚泓院士提出了“适体组学”的全新概念。

▶ 核心愿景

利用核酸适体作为可测序、标准化的分子探针，将蛋白质组、糖组等非核酸分子的信息转化为高通量的测序数据。SPARK-seq作为适体组学的底层技术支撑，实现了在单细胞水平上基因型、转录表型与表面蛋白指纹的无缝整合。

▶ 未来应用前景

① 全景式表面蛋白图谱：构建覆盖数千种膜蛋白的通用适体库，实现对单膜蛋白组的高通量解析。

② 伴随诊断与分型：利用高特异性适体对患者样本进行快速分子分型，指导靶向用药。

③ 新型偶联药物（ApDC）：SPARK-seq筛选出的内吞型、高特异性适体，将为靶向递送系统提供优质的导向配体。

结语

SPARK-seq的问世，不仅提供了一种强有力的工具，更代表了一种研究范式的转变。它证明了通过多模态技术的深度融合，我们可以在保持生命体系天然复杂性的前提下，实现对分子互作的高精细度解析。随着“适体组学”的不断发展，基于核酸的分子工具将在解析生命奥秘与推动精准医疗中发挥不可替代的作用。

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▶ 弱/动态/瞬时互作：基于空间临近标记的特殊原理，可以动态捕获更多弱相互作用和瞬时相互作用的蛋白；

▶ 高亲和性：链霉亲和素的亲和效价强，且无需严格保证非变性条件，可以捕获更多膜蛋白的互作；

▶ 避免阴性结果：基于质谱定量数据进行无偏见的高通量筛选，可以获得大量蛋白相互作用信息，避免阴性结果；

▶ 精准筛选：基于定量差异、蛋白功能注释、互作网络核心节点等多维度分析，提供候选临近表达蛋白的清单；

▶ 原位精准表达：可选目标基因的原位标签表达，保留基因天然表达模式，提升研究科学性。

参考文献

Luo G, Song J, Fu Y, et al. SPARK-seq: A high-throughput platform for aptamer discovery and kinetic profiling. Science. 2026;391(6780):eadv6127.