1. Single-Cell RNA Sequencing Identifies 14 Distinct Cell Populations in Human Atherosclerotic Plaques
作者对18例颈动脉内膜切除术获得的人动脉粥样硬化斑块进行了消化和单细胞测序。一共得到3282个细胞，分为14个细胞群。
2. ECs Exhibited a Gene Expression Profile Indicative of Activation and Potential Transdifferentiation
随后作者对四群EC进行了进一步的分析。0, 1, 2群表达内皮经典marker，3群表达ACTA2，提示存在内皮间质转化。
3. Synthetic Phenotype Dominates in Plaque Smooth Muscle Cells
平滑肌是cluster8，一部分平滑肌表达KLF4，提示其向synthetic or macrophage-like phenotype转变。
4. Intraplaque T Cells Are Defined by Activation Status
随后是淋巴细胞，包括一个 B 细胞群（cluster 11）和4个 T 细胞群组成。为了更详细地定义 T 细胞，作者将 CD3+的 clusrer 0，1，3，4分为 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞。CD4+T 细胞的可以分为5个亚群（CD4.0-CD4.4），CD4.0 和 CD4.1 表达细胞毒性基因，如GZMA、GZMK和PRF1。CD4.0 还表达CD28和GZMB，表明这些细胞是细胞毒性 CD4+CD28null细胞，在此前的报道中被认为与不稳定心绞痛和重大心血管不良事件风险增加相关。此外，该细胞群中与适应性免疫反应相关的促炎症通路显著富集。通过流式细胞术，我们证实了 CD4+CD28null 细胞的细胞毒性特症，结果显示，与 CD4+CD28+细胞相比，CD4+CD28-细胞中含有更多的颗粒酶 B。CD4.2 和 CD4.4 表达IL7R、LEF1和SELL，这些基因与 naïve 和中央记忆表型相关。根据经典标记FOXP3、IL2RA和CTLA4的表达，最终确定 CD4.3 为调节性 T 细胞。有趣的是，我们还在该群中发现 FOXP3 与 RORA 、GATA3 共表达，RORA增强调节性 T 细胞的免疫抑制功能，GATA3阻止向其他 Th亚群极化。
5. Both Proinflammatory and Anti-inflammatory Macrophage Populations Reside in the Plaque
巨噬细胞也分为5个群。My0, 1, 2分别代表了不同的巨噬细胞活化状态（3核4分别是DC和T）。0和1高表达炎症相关基因，参与炎症反应。My.0 showed characteristics of recently recruited macrophages，My.1 represented macrophages that differentially expressed tumor necrosis factor (TNF) and toll-like receptors。和0群、1群相对，2群高表达泡沫细胞marker基因：ABCA1,42 ABCG1, MMP9, 和 OLR1，促纤维化基因TREM2，和CD9。而且功能富集结果提示这群细胞主要参与代谢反应。
此外，除了表达经典巨噬marker如LGALS3 和 CD68，这群细胞还表达平滑肌的marker ACTA2。但是它表达髓系TF比如PU.1 (SPI1) and C/EBPß (CEBPB [CCAAT enhancer binding protein beta])，不表达SMC的TF如MYOCD (myocardin) 和 MRTF-A (MRTFA [myocardin related transcription factor A])。提示这群细胞gained characteristics of SMCs rather than that it originated from SMCs。
随后作者做了通路富集和转录因子预测。结果提示0群和1群主要参与炎症反应通路，受到炎性TF如IL1A, IFN (interferon) A, IFNG, 和 IL1B的调控。My2则主要富集到代谢和LXR/ RXR (liver X receptor/retinoid X receptor)活化通路，与其foamy phenotype相一致。此外这群细胞特异性的受到抗炎因子如STAT6的调控，并受到经典泡沫细胞相关分子包括APOE 和 the LXR family (Nr1h [nuclear receptor subfamily 1 group H]: NR1H2,3,4)的调控。
和动脉粥样硬化小鼠单细胞的数据相对照：
My.0 showed no statistically significant overlap, but most resembled inflammatory mouse macrophages.
My.1 resembled inflammatory, resident-like mouse macrophages.
My.2 overlapped with foamy, anti-inflammatory, Trem2+ macrophages.
Together, this confirms the recently migrated and embedded inflam- matory phenotypes we defined, respectively, for My.0 and My.1 and matches the foamy phenotype we saw in My.2. It also showcases a decent concordance between human patients and mouse models in relation to cell type diversity.
6. Intercellular Communication Drives Inflammation Within the Plaque
接下来，作者使用 CellPhone DB v2.0 进行了细胞互作分析。淋巴细胞和肥大细胞的潜在相互作用绝对数量最低，而髓系细胞、内皮细胞和 SMCs 的相互作用数量较高。随后，作者对髓系细胞的互作进行了进一步分析，观察到髓系细胞亚群的CSF1R与内皮细胞、平滑肌细胞、肥大细胞和髓系细胞上的CSF1相互作用。CCR1、CCR5与 CD4+和 CD8+T 细胞的CCL5相互作用，B 细胞的CXCR4与 My.1 细胞的CXCL12相互作用。髓系细胞具有吸引其他白细胞的潜能，例如 My.1 通过表达CCL3吸引 CCR5+T 细胞。此外髓系亚群上的PDGFB与内皮细胞上的PDGFBR相互作用表明，可能是髓系驱动的血管生成，这与斑块的不稳定有关。
7. Chromatin Accessibility of Myeloid and T-Cell Populations Reveals Transcription Factors Involved in Gene Regulation
作者还进行了scATACseq，一共鉴定出4个髓系和5个T细胞亚群。
结果显示My.0巨噬主要富集到NFATC3，这个转录因子主要参与TLR信号通路的活化以及调控TNFα 和 IL-1ß的分泌。My.1主要富集到促炎TF motif，如IRF1 (interferon regulatory factor 1), IRF9, STAT1, 和 STAT2。My.2则主要富集到anti-inflammatory, foam cell–associated TFs。例如KLF4，参与抗炎性巨噬细胞的激活和transformation of vascular SMCs to macrophages。
8. Cell Type–Specific Enrichment of Genes in GWAS Loci.
最后作者联合GWAS的数据进行了分析。
GWAS 研究已经发现了163个与冠心病相关的遗传易感性位点。然而，识别潜在关键基因作为新的治疗靶点仍然存在挑战。为此，作者 在 scRNA-seq 细胞群中评估了这些基因的表达，以研究它们在疾病相关组织中的表达。作者优先探究了317个蛋白质编码基因。我们比较317个 CAD 相关基因与3876个细胞群特征基因，结果有74个基因明显重叠。其中，内皮细胞的 cluster9，10中高表达SHE，KCNN3，VAMP5，SEMA3F，HDAC9，GIMAP1,NOS3,和DOCK6。巨噬细胞基因表达包含AMPD2、CTSS、IL6R、CAPG、GPX1、GNAI2、TRIB1、SH2B3、FES、C19orf38和VASP。平滑肌细胞群 cluster8 和 CD34+EC cluster10 高表达ITGB、ARHGEF26、CXCL12、PTPN11、COL4A1、COL4A2、KANK2和GGT5。
