引言

蛋白相互作用是细胞信号传导、代谢调控等生命活动的核心基础，传统研究方法（如免疫共沉淀）常受限于弱相互作用、瞬时相互作用或难溶性蛋白的捕获。邻近标记质谱（PL-MS）可破解这一难题，该技术具备活细胞原位标记、空间分辨率高、无需直接结合、标记效率高的优势，广泛用于胞内复合物解析、膜蛋白互作网络构建、亚细胞结构相关蛋白筛选等场景。

相较于早期BioID（标记需16-24小时），TurboID标记仅需10分钟，能减少细胞应激导致的假阳性，且技术成熟、流程易标准化。因此本指南以TurboID为核心示例展开，系统梳理从质粒构建、细胞标记、样品制备到质谱检测与数据分析的全流程，无需复杂的前期经验即可上手。

核心原理

利用融合了生物素连接酶的诱饵蛋白，在细胞内对外源添加的生物素进行活化，产生高反应活性的生物素-AMP中间体，该中间体能迅速与周围（~10nm半径内）邻近蛋白的赖氨酸残基发生共价键结合，随后通过链霉亲和素富集并进行质谱鉴定。

第一阶段：质粒构建与细胞模型

1. 获取目标蛋白基因序列&融合策略设计

▶基因获取：通过NCBI Gene或UniProt查询目标蛋白（POI, Protein of Interest）的CDS序列。使用高保真酶（如Phusion/Q5）从cDNA模板扩增，或直接合成。

▶融合方向（关键）：邻近标记存在空间位阻效应。

▶建议策略：构建两个版本：【N-term-TurboID-POI】和【POI-TurboID-C-term】。

▶Linker：在TurboID和POI之间加入柔性Linker（如Gly-Gly-Gly-Gly-Ser），避免折叠干扰。

▶对照组设计（必须）：

▶阴性对照：表达带有相同Tag和核定位/外排信号的TurboID（如TurboID-3xFLAG-NLS/NES）或空载TurboID，这是去除背景非特异性结合蛋白的关键。

2. 质粒构建与基因编辑

▶载体选择：慢病毒载体（如pLVX, pCDH系列）适用于难转染细胞；普通过表达载体（pcDNA3.1）适用于HEK293T。

▶稳转株构建（推荐）：瞬转虽然快，但蛋白表达水平差异大，影响定量。建议通过慢病毒感染+抗生素筛选构建稳定表达细胞株。

▶注意：验证表达水平时，Western Blot检测TurboID标签（通常为V5或HA）和POI。切忌过量表达，这会导致非特异性标记增加，应尽量接近内源水平。

第二阶段：细胞标记与样品制备

1. 细胞培养与邻近标记

▶细胞量：每个重复建议准备2×15cm培养皿（约2-4×10^7个细胞）。每个组别（实验组、对照组）至少设3个生物学重复。

▶标记步骤（TurboID版）：

① 细胞生长至80%-90%汇合度。

② 加生物素：向培养基中加入500µM Biotin（母液用DMSO配制）。

③ 孵育：37°C培养箱孵育10分钟（BioID需16-24小时，TurboID仅需10分钟，严控时间）。

④ 终止：立即吸去培养基，将培养皿置于冰上。

⑤ 洗涤：用预冷的1×PBS洗涤细胞5次。必须彻底洗去游离生物素，否则会竞争后续的磁珠结合位点。

2. 蛋白提取与亲和纯化

▶裂解：

① 加入1mL RIPA Lysis Buffer (50mM Tris pH 8.0, 150mM NaCl, 1%NP-40, 0.5% Sodium Deoxycholate, 0.1% SDS, Protease Inhibitor Cocktail)。

② 冰上裂解10-20min，超声破碎（切断DNA，降低粘度）。

③ 13,000g, 4°C离心10min，取上清。

▶富集：

① 使用Streptavidin Magnetic Beads。

② 孵育：将裂解液与磁珠在4°C旋转孵育1小时或过夜。

▶严苛洗涤：这是降低假阳性的核心步骤。

Wash 1: RIPA Buffer(2次)

Wash 2: 1M KCl(高盐去除非特异性静电吸附, 1次)

Wash 3: 0.1 M Na2CO3(高pH, 1次)

Wash 4: 2M Urea in 10mM Tris pH 8.0(去除非共价结合, 1次)

Wash 5: RIPA Buffer(2次)

Wash 6: 50 mM NH4HCO3(置换Buffer，为酶解做准备, 3-5次)

3. 蛋白酶解

▶还原烷基化：

加入10mM DTT，56°C孵育30min。

加入55mM IAA，室温避光孵育20min。

▶酶解：

直接向磁珠悬液中加入Trypsin(质谱级胰蛋白酶)，酶:蛋白比例约1:50。

37°C摇床孵育16-18小时。

▶提取肽段：离心收集上清，用含0.1% FA的乙腈溶液再次洗涤磁珠回收残留肽段。合并上清，SpeedVac抽干。

第三阶段：质谱检测与分析

1. 质谱检测(LC-MS/MS)

▶设备：推荐使用高灵敏度仪器，如Orbitrap Exploris 480或TimsTOF Pro。

▶模式：DDA是标准模式；若需精确定量，建议DIA。

▶上机：肽段重悬于0.1% FA中，进行液相色谱分离（通常90-120min梯度）后进入质谱。

2. 数据分析与PPI网络构建

▶搜库：

软件：MaxQuant (免费, 常用) 或 Proteome Discoverer (商业)。

设置：Fixed modification: Carbamidomethyl (C); Variable modification: Oxidation (M), Biotinylation (K)(这一步可选，但在PL-MS中通常直接看蛋白丰度，不一定非要搜到生物素化位点)。

定量方式：Label-free Quantification (LFQ) 或 iBAQ。

▶互作蛋白筛选：

SAINTexpress：这是分析AP-MS/PL-MS数据的金标准算法。它会计算每个蛋白在实验组相对于对照组的概率评分 (SAINT Score / BFDR)。

CRAPome数据库：将结果与CRAPome数据库比对，剔除常见的背景污染蛋白（如角蛋白、核糖体蛋白、组蛋白等）。

判定标准(示例)：Fold Change (实验组/对照组) > 2-4倍，且BFDR < 0.01。

▶网络构建：

Cytoscape：导入筛选后的差异蛋白列表。

STRING App：在Cytoscape中安装STRING插件，将你的蛋白映射到已知PPI网络中，进行聚类分析（MCODE）和功能富集分析（GO/KEGG）。

注意事项

1.内源性生物素干扰：哺乳动物细胞中含有内源性生物素化蛋白（主要是线粒体中的羧化酶，如PCCA,PCCB,MCCC1,ACACA）。在质谱结果中看到这些是正常的，作为内参即可，不用惊慌。

2.对照组至关重要：必须有"TurboID-Only"对照。PL-MS极其灵敏，没有对照无法区分哪些是真正的互作，哪些是“路人”蛋白。

3.空间分辨率：记住PL-MS标记的是“邻居”，不一定是直接物理结合。它能标记半径约10nm范围内的所有蛋白。

4.验证：质谱找到的候选蛋白，必须通过Co-IP或免疫荧光共定位进行传统的生化验证。

结语

PL-MS以其独特的活细胞原位标记优势，已成为解析蛋白质相互作用网络的核心工具，尤其为传统方法难以研究的复杂体系提供了高效解决方案。本指南围绕TurboID系统，构建了从质粒构建、细胞模型建立到质谱分析的完整实验框架。希望本指南能为初学者扫清技术障碍，帮助你快速掌握PL-MS的核心逻辑与操作要点，在蛋白质相互作用研究中获得可靠的实验结果。

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▶ 弱/动态/瞬时互作：基于空间临近标记的特殊原理，可以动态捕获更多弱相互作用和瞬时相互作用的蛋白；

▶ 高亲和性：链霉亲和素的亲和效价强，且无需严格保证非变性条件，可以捕获更多膜蛋白的互作；

▶ 避免阴性结果：基于质谱定量数据进行无偏见的高通量筛选，可以获得大量蛋白相互作用信息，避免阴性结果；

▶ 精准筛选：基于定量差异、蛋白功能注释、互作网络核心节点等多维度分析，提供候选临近表达蛋白的清单；

▶ 原位精准表达：可选目标基因的原位标签表达，保留基因天然表达模式，提升研究科学性。

参考文献

1. Branon TC, Bosch JA, Sanchez AD, et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nat Biotechnol. 2018;36(9):880-887. 

2. Cho KF, Branon TC, Udeshi ND, Myers SA, Carr SA, Ting AY. Proximity labeling in mammalian cells with TurboID and split-TurboID. Nat Protoc. 2020;15(12):3971-3999.

3. Habel JE. Biotin Proximity Labeling for Protein-Protein Interaction Discovery: The BioID Method. Methods Mol Biol. 2021;2261:357-379. 

4. Teo G, Liu G, Zhang J, Nesvizhskii AI, Gingras AC, Choi H. SAINTexpress: improvements and additional features in Significance Analysis of INTeractome software. J Proteomics. 2014;100:37-43.