张泽民大佬刚刚online的nature，来学习一下。
原发性肝癌(primary liver cancer, PLC)有三种主要的组织学亚型-肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)，肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)和肝细胞和肝内胆管癌合并(combined hepatocellular and intrahepatic cholangiocarcinoma, CHC)。尽管免疫治疗最近取得了进展，但我们对PLC的肿瘤免疫微环境基线情况的了解有限，从而排除了生物标志物的识别，以更好地对患者进行分层。因此需要一项全面的单细胞研究，包括大多数细胞群和PLC的三个主要亚型，并具有既定的临床参数。
肿瘤免疫微环境(tumour immune microenvironment, TIME)由各种免疫细胞和基质细胞组织，其异质性是肿瘤转移、复发和耐药的主要促成因素，但不同的TIME亚型与肝癌的临床相关性之间的关系尚不清楚。
这项研究分析了189个肝癌患者和小鼠模型样本的细胞景观，解剖了TIME亚型，从而揭示了肝癌免疫微环境亚型和中性粒细胞异质性。
1. A large-scale single-cell atlas of liver cancer
Fig 1：为了探究PLC的细胞群异质性，作者对来自124个原发性肝癌患者的（79 HCC, 25 ICC 和 7 CHC）160个样本进行了单细胞测序。得到了1,092,172个细胞，鉴定为89 TIME细胞群。
2. Cellular module analyses reveal five TIME subtypes
Fig 2a：Hierarchy clustering 鉴定出5个 stable cellular modules (CM1–CM5)。也就是5个免疫微环境亚型（TIMELASER）。
Fig 2b-d：基于CM1–CM5的富集评分，作者将所有的患者区分为5个TIME subtypes。其中包含：免疫激活型TIME-IA (Immune Activation);髓系富集免疫抑制型TIME-ISM (Immune Suppressive Myeloid);基质富集免疫抑制型TIME-ISS (Immune Suppressive Stromal);免疫排斥型Immune Exclusion (TIME-IE);免疫驻留型(Immune Residence)，组合起来称之为TIMELASER分型系统。
Fig 2e：五种分型的患者预后
Fig 2f：以TIME-IE为例，免疫荧光验证了免疫微环境亚型的存在。
3. TIMELASER subtypes exhibit distinct features
Fig 2g-h：通过受体配体分析发现每种亚型均存在不同的趋化因子受体-配体网络，提示了不同亚型的形成机制。TIME-IA 和 TIME-ISM亚型的tumour和TIME细胞存在一致的趋化因子表达模式，提示存在positive-feedback loops。例如CXCL9/10/11–CXCR3 受体配体对在 TIME-IA中富集, 而 CXCL1/3/8–CXCR2 受体配体对则在TIME-ISM 中富集。
4. Neutrophil heterogeneity in liver cancer
TIME-ISM中多种中性粒细胞亚群的富集以及其不良预后使得作者想要对中性粒进行进一步探究。
Fig 3a-b：在人样本的34,307个中性粒中，作者一共鉴定出11个亚群。不同的亚群具有不同的肿瘤偏好性。Neu_02_S100A12, Neu_03_ISG15 和 Neu_04_TXNIP 主要是外周血中性粒 (PBNs), 而 Neu_05_ELL2 和 Neu_06_PTGS2 主要是 adjacent liver neutrophils (ALNs)。其他的六个亚群 (Neu_01_MMP8, Neu_07_APOA2, Neu_08_CD74, Neu_09_IFIT1, Neu_10_SPP1 和 Neu_11_CCL4) 则主要在肿瘤中富集，也就是TANs。
Fig3a的结果还提示存在着从PBNs--ALNs--TANs的分化轨迹。
Fig 3c：转录因子分析提示不同中性粒亚群受到不同的转录因子调控。例如PAN中SPI1高度活化， ALNs 和 TANs中 NFE2L2 和 CREM则活性更强。MAFG, BHLHE40 和 HES4在 TANs中高度活化，可能参与肿瘤中的中性粒细胞重编程。
5. Chemokine secretion and immunosuppression phenotypes of TANs
作者随后主要关注了两个TAN亚群Neu_11_CCL4 和 Neu_09_IFIT1 的功能。
Fig 3d：Neu_11_CCL4高表达趋化因子CCL3 和 CCL4。
Fig 3e：体外诱导的TANs同样高表达CCL4。
Fig 3f, g：随后作者通过ex vivo analysis探究了patient-derived TANs 和非肿瘤中性粒细胞的趋化因子分泌情况。结果显示和non-TANs相比, TANs显示出 higher accessibility signals of CCL4 and CCL4 protein secretion。
Fig 3h：TAN对单核细胞的趋化作用也更强。These results validate the chemokine-secreting function of TANs and support that CCL4+ TANs could recruit macrophages.
Fig 3i：同样的，作者发现和非肿瘤细胞相比，TANs的CD274 (编码 PD-L1)表达显著更高，尤其是Neu_09_IFIT1。
Fig 3j：in vitro induced TANs的CD274表达呈现时间依赖性，时间越长，表达越多。
Fig 3k：流式结果也显示和正常组相比，induced TANs显示出更高的PD-L1表达。
Fig 3l-m：ATAC-seq 和 FAC结果也显示patient-derived TANs存在higher accessibility signals of CD274 and PD-L1 expression。
为了探究TANs的高PD-L1表达可以直接抑制T细胞活性，作者将CD8+ T细胞和in vitro induced TANs共培养。
Fig 3n, o：结果显示和TANs共培养的CD8+ T的IFN-r表达下降，给PD-L1抗体后这种现象消失。提示PD-L1 介导了TAN的免疫抑制作用。
Fig 3p：此外，和人TANs共培养的autologous CD8+ T细胞的IFNγ, GZMB, PRF1 和 CD25 表达水平更低。
Fig 3q：免疫荧光结果显示PD-L1+ 中性粒细胞和 PD1+ CD8+ T细胞存在空间上的共定位，提示它们存在直接互作。
These results together demonstrate that PD-L1+ TANs suppress cytotoxic CD8+ T cells in PLC.
6. Conserved neutrophil subsets in human and mouse liver cancer
为了进一步在体探究TANs的异质性，作者构建了两个新的自发性肝癌小鼠模型， with the pTMC mice developing mainly HCC and pTMK mice developing mainly ICC。作者对6只小鼠的21个样本（包括外周血，癌旁和癌组织）进行了单细胞测序。
Fig 4a-b：作者一共得到17,780个中性粒，分为12个cluster。和人的中性粒一样(Fig 3a)，小鼠中性粒细胞也存在从PBNs--ALNs--TANs的分化轨迹。
Fig 4c：对人和小鼠的数据进行相关性分析发现中性粒细胞在物种间保守。
Fig 4d：尤其值得注意的是，3种来自人TIME-ISM (Neu_09/10/11)的TAN 亚群和小鼠的mNeu_10/11/12相对应。和人类TANs一致，在小鼠TANs中也观测到了 Cd274 的高表达。
7. Neutrophil depletion attenuates tumour progression
TIME-ISM TANs (Neu_09/10/11)的综合促肿瘤作用使得作者想要去进一步探究体内消除这些促肿瘤TANs的治疗作用。
As a combinatory in vivo elimination strategy specifically targeting Neu_09/10/11 was not available, we reasoned that neutrophil depletion using anti-Ly6G antibodies might be the most proximate way to mimic such therapy.
Fig 4e, f：中性粒细胞清除之后，肿瘤结节显著减少，肿瘤缩小。
Fig 4g, h：TANs的数量 和 表达PD-L1的 TANs在治疗后都显著下降。尽管CD8T细胞的数量没有变化，它们的耗竭状态减轻（PD-1和TIM3等检查点marker表达下降）。总的中性粒细胞数量和增殖肿瘤细胞数量也下降。
Fig 4i-j：另外一个小鼠模型也是一样的效果。
总的来说，这项研究描绘了PLC的全面细胞景观，使我们能够识别五种TIMELASER亚型并解码中性粒细胞异质性。TIMELASER框架覆盖了大多数细胞群，并提供了显示空间分辨率的基线TIME亚型的无偏分层。进一步探索中性粒细胞对免疫治疗的影响以及相关的混杂临床因素将为更好地理解TAN生物学提供新的机会，并提出肝癌治疗的转化研究路径。
