关键词：CD14+ 单核细胞，免疫磁珠细胞分选，CAR-T，CT-0508，细胞功能测定
1.1 什么是单核细胞
造血干细胞（HSC）存在于骨髓中，在造血过程中产生血细胞。造血干细胞分化为淋巴和髓系，进一步分化为成熟血细胞类型（图1）。
图1：造血干细胞的分化谱系
单核细胞是髓系的大颗粒白细胞，占循环白细胞的5% -10% 。它们的特征是表达CD14细胞表面受体。单核细胞一旦进入组织，就能够分化成巨噬细胞和树突状细胞。单核细胞在免疫系统中起着三个关键作用: 吞噬、抗原呈现和细胞因子的产生。
1.2 单核细胞亚群
人类存在三种类型的单核细胞，这三种单核细胞亚群表型和功能呈现异质性：
经典单核细胞（CD14+, CD16−）
中间单核细胞（CD14+, CD16+）
非经典单核细胞 （CD14dim, CD16+）
经典的单核细胞表现出更多的促炎症表型，能够分泌可溶性细胞因子，并分化成树突状细胞，以桥接先天性和适应性免疫反应。中间单核细胞专门负责抗原呈递，在 HIV 感染中发挥重要作用。最后，非经典单核细胞负责抗病毒和抗肿瘤反应。
1.3 研究应用
体外培养单核细胞的能力不仅对于免疫学研究至关重要，而且对于细胞和基因疗法也很重要。最近，一项研究利用基因工程修饰病人来源的单核细胞作为治疗复发性急性骨髓性白血病（AML）的策略（图2）[1]。
图2：三顺反子整合酶缺陷型慢病毒载体设计和重编程单核细胞自我分化为诱导型树突状细胞（iDC）。在 CliniMACS Prodigy 自动化系统中，从 AML 患者或 HSCT 供体获得的 CD14+单核细胞被富集并用高滴度慢病毒载体转导。经过质量控制，冷冻保存的 iDC 细胞产品可以储存或运往其他临床中心。在将产品解冻和皮内给药到患者后，iDC 将分泌 GM-CSF 和 IFN-α2 并处理抗原，刺激功能性 T 和 B 细胞应答的发展。联合的适应性反应将保护患者免于 AML 复发（tWT1抗原）或 HCMV 再激活（HCMV 抗原 pp65/gB）。
嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）过继治疗实体瘤适应症无效，主要是因为T细胞无法穿透实体瘤和抑制性肿瘤微环境（TME）。像 Carisma 这样的公司正在研究修饰其他免疫细胞，这些细胞可能更适合处理实体肿瘤，如 CAR 修饰的巨噬细胞（CAR-M）。他们的 CT-0508产品旨在治疗过度表达 HER2 的实体瘤。这些 CAR-Ms 能够以靶向的方式浸润 TME 和吞噬 HER2过表达的肿瘤细胞。同样，当肿瘤细胞被分解时，抗原加工和呈递给 T 细胞激活了后天免疫系统，增强了免疫反应。2020年7月，Carisma 治疗公司获得美国食品及药物管理局（FDA）批准，开始 CT-0508的首次人体内1期多中心临床试验。
1.4 单核细胞磁珠分选
阳性免疫磁珠分选使用 CD14+抗体从异质细胞群中结合/分离单核细胞。相反，阴性选择用针对非单核细胞的抗体或配体标记不需要的细胞类型，去除 CD14-单核细胞。选择正确的分离方法取决于下游应用[2]。正向选择的单核细胞在分析测定（基因组学，FACS 等）中最有用，而负向选择的单核细胞通常优先用于功能测定（基于细胞的功能测定）（图3）。
图3：阳性和阴性免疫磁珠分选 CD14+单核细胞的比较。
1.5 阴性磁珠分选适合细胞功能研究
与阴性分选的 CD14+单核细胞相比，我们观察到阳性分选的 CD14+单核细胞在 LPS 刺激下 LPS 敏感性受损，激活和增殖能力较差。附着的微球不降解，即使在培养6天后仍附着在细胞上（图4）[2]。
图4：CD14+细胞培养数天后未结合抗CD14微球的细胞百分比。
从 PBMC 中正向分选 CD14+单核细胞后，单核细胞上的表面 CD14分子被抗 CD14微球阻断，这些 CD14+表面位点不再介导 LPS 的刺激，正向分选的 CD14+单核细胞可能表现出受损的 LPS 刺激。这些结论表明，对于大多数实验，阳性分离的细胞只能用于分析目的，不应该用于任何进一步的培养实验，细胞功能研究时应该采用阴性选择。
1.6 参考文献
[1] Bialek-Waldmann, J. K., Heuser, M., Ganser, A. & Stripecke, R. Monocytes reprogrammed with lentiviral vectors co-expressing GM-CSF, IFN-α2 and antigens for personalized immune therapy of acute leukemia pre- or post-stem cell transplantation.Cancer immunology, immunotherapy: CII68, 1891–1899 (2019).
[2] Bhattacharjee, J., Das, B., Mishra, A., Sahay, P. & Upadhyay, P. Monocytes isolated by positive and negative magnetic sorting techniques show different molecular characteristics and immunophenotypic behaviour.F1000Research6, 2045 (2017).
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