引言
做病毒学研究的朋友都知道，病毒是典型的“胞内寄生虫”，它的一生——从入侵、复制到组装释放，完全依赖于宿主细胞的分子机器。我们要想搞清楚病毒的致病机理，或者寻找新的抗病毒靶点，核心任务就是回答一个问题：病毒蛋白到底和谁（宿主蛋白）在一起？
近年来，邻近标记技术（Proximity Labeling, PL） 异军突起。无论是BioID、TurboID还是APEX，它们就像给病毒蛋白装上了一个“喷漆罐”，能给周围几纳米内的所有邻居打上永久的生物素标签，不管它们结合得紧不紧，只要“挨得近”，就能被捕获。
今天，小谱将结合三篇非常经典的病毒学文献（涵盖新冠病毒、小鼠肝炎病毒和流感病毒），和大家聊聊这项技术是如何颠覆我们对病毒-宿主互作认知的，以及我们在实际课题设计中可以如何借鉴。
01 全景互作组学：SARS-CoV-2病毒-宿主蛋白网络的高通量解析
在此次新冠疫情期间，多伦多大学Anne-Claude Gingras团队发表的一项工作，堪称邻近标记技术应用的教科书级案例。
1. 研究策略
研究者构建了27个SARS-CoV-2病毒蛋白的BioID载体。特别值得注意的是，他们使用的是miniTurbo（一种改良的快速生物素连接酶），只需要标记10-15分钟。相比传统BirA需要标记十几小时，miniTurbo能捕捉到更动态、更实时的互作网络，大大降低了背景噪音。
2. 核心发现与小谱的思考
该研究通过邻近标记鉴定出了7810个互作关系。其中有几个点非常值得我们深思：
① 亚细胞定位与膜蛋白互作：很多病毒蛋白（如ORF9b）定位在细胞器膜上。传统IP很难把膜蛋白拉下来，或者拉下来时膜结构已经破坏。但这项研究清晰地发现ORF9b富集在线粒体外膜，并特异性地与宿主蛋白TOMM70互作。这直接提示了病毒可能通过干扰线粒体功能来逃避免疫监视。
② 基于互作的功能注释：通过分析N蛋白的邻近组，研究者发现了大量应激颗粒相关蛋白（如G3BP1、G3BP2）。随后的实验证实，N蛋白确实会通过结合G3BP1来抑制应激颗粒的形成。这展示了邻近标记的核心优势——通过“空间邻近”直接提示“生物学功能”。
【研究者笔记】如果你的课题涉及膜定位病毒蛋白（如包膜蛋白）或亚细胞器形态改变，强烈建议优先考虑BioID或TurboID构建全景图谱，而非受限于Co-IP的溶解性问题。
02 原位标记：冠状病毒复制-转录复合物（RTC）微环境的分子界定
如果说第一篇文献是“广度”，那么第二篇关于冠状病毒MHV的研究则展示了“深度”，特别是通过重组病毒实现原位标记的策略。
1. 研究背景
冠状病毒会在细胞内形成双层膜囊泡（DMVs）作为复制工厂。这个微环境高度封闭，难以通过常规手段分离。核心科学问题是：在这个封闭空间内，有哪些宿主因子参与了病毒复制？
2. 巧妙的设计
研究者做了一件非常聪明的事：他们利用反向遗传学技术，直接把生物素连接酶BirA融合到了病毒的非结构蛋白nsp2上。这样，重组病毒（MHV-BirA-nsp2）在感染细胞时，能在自然感染状态下原位标记复制-转录复合物（RTC）周围的宿主蛋白。
3. 颠覆性的发现
利用这种原位标记，他们在复制工厂附近发现了大量的翻译起始因子（如eIF3复合物）。 这打破了我们的传统认知！通常我们认为：病毒RNA在细胞质翻译，然后进到膜囊泡里复制。但这项研究通过邻近标记+核糖体嘌呤霉素标记技术证实：冠状病毒将宿主的翻译机器招募至复制工厂周边，实现了“复制-翻译”的高效空间偶联。
【研究者笔记】这篇文献给我们最大的启示是实验设计的灵活性。不仅仅是转染质粒表达融合蛋白，我们甚至可以构建携带PL酶的重组病毒。这种“野生”状态下的标记，比过表达质粒得出的数据更真实，也更具生物学意义。
03 比较互作组学：流感病毒宿主适应性与致病机制的差异化分析
第三个案例我们把目光转向流感病毒，这篇发表在《Viruses》上的研究展示了邻近标记技术在比较生物学与致病机理差异分析中的应用。
1. 科学问题
禽流感病毒和人流感病毒在致病性和宿主适应性上差异巨大。PB1-F2蛋白是一个关键的毒力因子，但其序列变异如何导致功能差异？传统的IP实验难以捕捉这种细微且往往瞬时的信号调控网络变化。
2. 研究策略
研究者利用BioID技术，分别构建了表达人流感病毒（H1N1）PB1-F2和禽流感病毒（H5N1）PB1-F2的载体，并在人细胞中进行标记和质谱分析。其核心逻辑是：通过比较同源蛋白的互作组差异，解析跨物种传播的分子壁垒。
3. 核心发现
结果显示，尽管序列相似，两者的邻近组截然不同：
① 人流感PB1-F2：主要富集Rho GTPase信号通路相关蛋白，提示其通过调节细胞骨架和信号传导影响干扰素反应。
② 禽流感PB1-F2：大量富集RNA加工和剪接因子（如HNRNP类蛋白），暗示在禽流感中，该蛋白可能直接参与病毒RNA代谢。
【研究者笔记】这个案例确立了比较互作组学的研究范式。对于涉及野生型vs 突变株、高致病性 vs 低致病性的课题，通过平行比较BioID数据，可以快速锁定导致表型差异的关键通路，这是单一互作研究无法实现的。
04 基于邻近标记的抗病毒靶点发现与药物筛选策略
邻近标记技术不仅是基础研究的利器，在抗病毒药物研发中也具有广阔前景：
① 动态互作组学与药效评估：利用Split-TurboID或APEX2的时间分辨率，我们可以设计药物处理前后的对比实验。观察药物是否成功破坏了关键的病毒-宿主互作（如解离ORF9b-TOMM70复合物），从而提供比病毒滴度更精细的**作用机制（MOA）数据。
② 靶向“不可成药”蛋白的策略：通过邻近标记发现病毒蛋白高度依赖的宿主因子（如流感PB1-F2依赖的Rho通路），我们可以通过靶向这些宿主蛋白，或者设计PROTAC分子来阻断特定的蛋白-蛋白相互作用（PPI），为抗病毒药物开发提供新靶点。
③ 体内标记的转化应用：未来的趋势是将重组病毒（如MHV-BirA）应用到动物模型中。在组织器官水平进行原位标记，将有助于我们理解病毒在复杂机体环境中的组织嗜性与免疫逃逸机制。
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基于邻近标记技术联合质谱的PL-MS蛋白邻近表达筛选解决方案，提供从细胞构建培养、亲和富集实验到质谱高通量筛选（阶段可选）：①目标序列获取和质粒克隆构建、②基因编辑和细胞系构建、③细胞培养和临近标记、④生物素标记蛋白的亲和纯化富集、⑤蛋白提取和酶解、⑥质谱检测和⑦数据分析和互作网络构建。
▶ 弱/动态/瞬时互作：基于空间临近标记的特殊原理，可以动态捕获更多弱相互作用和瞬时相互作用的蛋白；
▶ 高亲和性：链霉亲和素的亲和效价强，且无需严格保证非变性条件，可以捕获更多膜蛋白的互作；
▶ 避免阴性结果：基于质谱定量数据进行无偏见的高通量筛选，可以获得大量蛋白相互作用信息，避免阴性结果；
▶ 精准筛选：基于定量差异、蛋白功能注释、互作网络核心节点等多维度分析，提供候选临近表达蛋白的清单；
▶ 原位精准表达：可选目标基因的原位标签表达，保留基因天然表达模式，提升研究科学性。
参考文献
1. Samavarchi-Tehrani P, Abdouni H, Knight JDR, et al. A SARS-CoV-2 - host proximity interactome.bioRxiv. Preprint posted online September 4, 2020.
2. V'kovski P, Gerber M, Kelly J, et al. Determination of host proteins composing the microenvironment of coronavirus replicase complexes by proximity-labeling.eLife. 2019;8:e42037.
3. Mettier J, Prompt C, Bruder E, et al. Comparison of PB1-F2 proximity interactomes reveals functional differences between a human and an avian influenza virus.Viruses. 2023;15(2):328.
