第四章 免疫标记技术
经典免疫学技术的不足包括：灵敏度低，周期长，可重复性差，无法定量，无法定位，特异性差等问题。
免疫标记技术：用荧光素、放射性同位素、酶、发光即或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行抗原抗体反应。
分类：免疫酶技术、放射免疫技术、免疫标记技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术、发光免疫测定。
特点：高度灵敏、特异、快速、定性、定量、定位
第一节 放射免疫技术
一、放射免疫技术
（一）放射免疫技术的原理
适合检测小分子抗原，小分子较易生成，但是很难检测。
放射免疫测定技术：用放射性核素标记来检测抗原抗体反应的高灵敏度的技术。可用标记抗原或标记抗体检测相应的抗体或抗原。待测抗原和标记抗原对有限量抗体存在竞争性结合，Ag*+
Ab4>Ag*-Ab; Ag + Ab一Ag-Ab; 抗原用核素标记后仍能与相应抗体特异性结合; 将两类抗原与抗体混合后，两类抗原均能与抗体结合，当Ag* 和Ab 的数量恒定，且Ag* 与Ag 之和大于Ab 上结合点数目时，Ag* 与Ag 存在竞争抑制: Ag 数量增加，Ag-Ab生成量增加; Ag*-Ab 数量就减少，游离的Ag* 就增多。用层析等方法将Ag*-Ab 和Ag-Ab复合物(B) 与游离Ag*和Ag (F) 分离，测定B和F的放射活性。
（二）放射免疫技术的基本条件
1.抗原标准样品与待测抗原
标准品是放免技术的定量依据：
标准品：与待测样品的化学结构完全相同。
替代品：与待测样品的化学结构相似，但是需要与抗体的亲和力相近，应该列出真标准品的换算系数。
2.放射性同位素：3H、32P、35S常见的生命科学同位素标记
3.特异性抗体：
放射免疫的抗体应具备：特异性高、亲和力高（K值大）、效价高，也就是说，即使是稀释之后仍然能够迅速与抗原结合，极少解离，保证了检测的灵敏度。
4.常用的同位素标记方法：氯胺T氧化标记法、乳过氧化物酶标记法、半抗原标记法。
5.B与F分离技术：结合态标记抗原B与游离态标记抗原F能够有效分离是放射免疫技术的重要环节。
分离剂的要求：能使B与F完全分离，不能受外界因素的干扰、与有力抗原的非特异性作用尽量小、操作简单、分离迅速、重复性好、来源广、经济、便于使用。
（1）双抗体沉淀分离法：加入第二抗体是原来不能分离的微量抗原抗体复合物的分子加大，从而使原来不能用普通离心法沉淀的抗原抗体复合物易于沉淀而分离。优点：操作简单、稳定。缺点：容易受到其他蛋白质或盐的干扰，二抗消耗量较大。
（2）化学试剂分段沉淀法：利用盐类或有机化合物使反应也中的γ-球蛋白在等电点沉淀，从而达到分离的目的。优点：实际来源广泛，价格便宜。缺点：影响因素多。
（3）固相法：将测定用的第一抗体（或第二抗体）牢固的结合在固相载体表面，相应的抗原（或第一抗体）经过孵育被吸附，只要将固相表面洗涤即可。优点：操作简便，快速。新的固相分离方法：纤维固相抗体竞争法、可磁化颗粒固相抗体竞争法、试管固相法。
（4）吸附法：本法多适用于小分子半抗原的放射免疫分析。比如说活性炭、硅镁吸附剂，滑石粉等对蛋白质、多肽、药物等具有非特异性的吸附能力。在其表面包裹一层白蛋白或者右旋糖苷等物质时，就会限制大分子物质的吸附。
（三）放射免疫技术的基本类型
1.液相法
1（1）平衡法：三者同时加样竞争
（2）顺序加样法：待测抗原限于抗体结合在家标准抗原
2.固相法
（1）竞争法：待测抗原、标准抗原、阴性对照
（2）改良法：待测抗原、标准抗原、游离的抗原、结合在固相载体上的二抗。
