A Comprehensive Proteomic and Phosphoproteomic Analysis of Retinal Pigment Epithelium Reveals Multiple Pathway Alterations in Response to the Inflammatory Stimuli
视网膜色素上皮的全面蛋白质组和磷酸化蛋白质组学分析揭示了对炎症刺激的多种途径改变
期刊：Int J Mol Sci (IF = 4.556)
发表单位：首尔国立大学
导 读
RNAsesq，蛋白质组学，磷酸化组学等组学分析文章是很常见的，但大多影响因子较低，为什么，我们看看这篇文章是怎么做的。
摘 要
视网膜色素上皮（RPE）持续性炎症会引起视网膜环境的破坏性变化，但是确切的机制仍不清楚。在这项研究中，旨在研究针对强烈炎症的RPE特异性生物学和代谢反应，并确定决定病理进展的分子特征。使用最新的等压串联质谱标签（TMT）标记方法对脂多糖（LPS）处理45分钟至24小时后，对人源RPE细胞系ARPE-19的蛋白质组和磷酸化蛋白质组进行了定量分析。共鉴定了8984种蛋白质，其中LPS处理24小时后261种蛋白质的丰度变化了1.5倍。磷酸化蛋白质组分析确定了来自3207个磷蛋白的20632个独特的磷肽，具有3103个磷酸化位点。蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学的综合分析显示，LPS刺激后，与线粒体呼吸作用和细胞周期检查点相关的蛋白质显著下调，而与脂质代谢、氨基酸代谢、细胞基质粘附和内质网（ER）应激相关的蛋白质上调。此外，已确定包括MAPKK和Wnt /β-catenin信号传导在内的多种途径的磷酸化事件均与LPS触发的病理生物学有关。从本质上讲，本研究的发现揭示了RPE在炎症下施加的多种整合信号，并有望为RPE疾病治疗干预的发展提供见识。
前 言
视网膜色素上皮（RPE）是位于视网膜和脉络膜之间的六边形色素细胞层。许多研究指出，由复杂的生物紊乱引起的持续性炎症，会刺激免疫细胞的募集和活化，加剧新陈代谢，导致RPE的病理生物学变化。但是，尚不清楚导致RPE发生这些破坏性变化的确切机制，必须进一步了解确定疾病进展的RPE特异性炎症反应。
高灵敏度串联质谱标签（TMT）标记方法与高分辨率质谱联用是最近开发的蛋白质组技术，可以识别数千种蛋白质，具有更高的覆盖率和准确性。本研究通过对源自人的RPE细胞系ARPE-19进行基于TMT标签的定量分析，试图阐明脂多糖（LPS）诱导的炎症细胞中蛋白质组和磷酸化蛋白质组中的差异表达模式，并鉴定异常途径如何诱导RPE变性表型。
方 法
在指定的时间内（45分钟和24小时；n = 3）用不同浓度的脂多糖（LPS）刺激ARPE-19细胞，进行下游蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。
使用Perseus软件进行蛋白质组学数据的统计分析。t检验用于鉴定蛋白质表达的统计学显著性差异，以及分析磷酸蛋白质组数据集的磷酸化水平的统计学显著性差异水平。对于分层聚类分析，使用单因素方差分析进行了多个样本检验。使用Cytoscape工具ClueGO插件实现基因本体（GO）注释和途径富集分析。基因集富集分析（GSEA）分析蛋白质定量数据，并以密度图显示了相对于整个数据集的基因集丰度。使用STRING数据库分析差异蛋白质组和磷酸化蛋白质组中蛋白质相互作用网络分析。
更详细的材料和方法可以在在线补充材料中找到。
结 果
1 诱导炎症的ARPE-19蛋白质组学（描述细胞模型）
为了确定可引起RPE代谢和促炎反应的脂多糖（LPS）浓度，使用不同浓度的LPS评估了细胞外酸化率（ECAR）/耗氧率（OCR）和炎性细胞因子水平，炎症驱动的病理进展已在24小时内开始。LPS处理后30分钟至1小时之间显示出明显的代谢变化，这意味着在这两个时间点之间已经开始了重要的信号级联反应。
通过细胞动力学评估，作者将45分钟时用于早期信号转导事件，在24小时时用于后期蛋白质组变化。
2 定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析（整体描述组学数据）
随后是对蛋白组和磷酸化蛋白组的整体概况，包括鉴定蛋白的数量，差异蛋白数量等。
相关性或主成分分析（PCA）均显示出良好的生物学重复，以及组间差异。8984个蛋白中鉴定出130878个独特的肽，平均序列覆盖率为31％，有261种蛋白质差异表达。从具有3103个磷酸化位点的3207个磷蛋白中鉴定出20632个独特的磷酸肽，发现2561个蛋白质在蛋白质和磷酸化蛋白质之间重叠。大多数磷蛋白在早期或晚期时间点均不受LPS刺激的显著影响，因为平均log2倍变化集中在零附近。
3 鉴定蛋白质的功能注释（蛋白质组学功能富集分析）
为了研究与炎症驱动的病理学相关的生物学过程，进行了层次聚类和基因本体（GO）富集分析。45分钟的差异蛋白数量较少，通路富集不明显。24小时的4192个差异蛋白的GO分析显示，与线粒体代谢和细胞周期检查点有关的蛋白质下调，脂质和氨基酸代谢的扰动以及细胞-基质粘附、内质网（ER）应激和外在凋亡信号上调。
为了获得与差异表达模式相关的功能性蛋白质谱，还使用基因集富集分析（GSEA）。在重大的代谢扰动中，研究中的153种上调和下调蛋白调节的两个重要途径，白细胞稳态和细胞-基质粘附。在RPE中，高迁移率族框1（HMGB1）和缺氧诱导因子1α（HIF1α）作为RPE中的促血管生成和促炎因子，在炎症过程丰度增加。细胞内粘附分子1（ICAM-1）、纤连蛋白1（FN1）、纤维蛋白-1（FBN1）和血小板反应蛋白1（THBS1）与细胞粘附有关，尤其是在高危RPE中上调。基质金属肽酶14（MMP14）强烈下调，它是维持Bruch膜（BrM）的结构元素，结缔粘附分子3（JAM3）的合成和分解之间的生理平衡的关键酶，调节N的募集 -钙黏着蛋白和ZO-1形成紧密连接，也因炎症而减少。（列举一些重要作用的蛋白或通路，简述功能和表达量改变的关系）
4 磷酸化蛋白质组分析（磷酸化组学数据分析）
进一步研究由蛋白质磷酸化和去磷酸化调控的LPS诱导的信号通路，聚类分析揭示了磷酸化进程的三种不同模式。簇1的差异磷酸化肽富集了胆固醇代谢、细胞衰老、细胞基质粘附和细胞死亡过程。簇2包括蛋白激酶活性、细胞对DNA损伤的反应以及对细胞因子的反应。簇3涉及p38 MAPK级联反应和β-catenin-TCF复合物组装。
并列举一些参与重要通路的蛋白，简述关键蛋白成分的磷酸化状态。参与NF-κB活化的蛋白激酶Cδ（PRKCD）在残基Ser-304处被磷酸化。β-catenin（CTNNB1）通过与NF-κB的串扰参与炎症调节，在残基Ser-552处被磷酸化。occludin（OCLN）的磷酸化已知发生在维持紧密连接完整性上，被鉴定为在残基Ser-321处明显去磷酸化。
5 蛋白质相互作用网络
构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，整合有关蛋白质丰度、激活状态和分子相互作用的信息，以确定蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学在炎症驱动的发病机理中的复杂相互作用。重点研究了基于GSEA和GO富集选择的106个关键的差异蛋白和30个差异磷酸蛋白。网络中包含136个节点和1094个边，表明它们是多功能的且相互依赖，并富集了RPE病理生物学密切相关的16个GO生物学过程术语。
讨 论
该项研究中通过蛋白质组和磷蛋白定量分析，创建视网膜色素上皮（RPE）中炎症驱动的生物和代谢变化的全局概述。在脂多糖（LPS）诱导炎症的ARPE-19细胞中总共鉴定出4490个差异表达蛋白和1561个差异磷酸化蛋白。发现与线粒体呼吸、细胞周期检查点和抗氧化系统有关的蛋白质显著下调，被认为与脂类代谢、氨基酸代谢、内质网应激、细胞-基质相互作用和细胞凋亡的强烈扰动有关。与MAPKK途径，Wnt /β-catenin途径和I-κB/NF-κB信号传导有关的早期磷酸化事件，以及随后与细胞衰老和细胞-基质粘附相关的蛋白质的磷酸化/去磷酸化被确定与发病机理有关。
点评：这篇文章用的3个时间点，做了蛋白质组学，磷酸化组学研究，不涉及其他的实验。数据分析也只是描述测序数据，差异的蛋白，对蛋白及位点稍作延伸，做了常规的GO/KEGG分析。是一篇比较典型的组学分析思路。
缺点：
1）只讨论自己的数据，如果与前人研究做些对比，类似模型的RNAseq数据，蛋白，代谢甚至是重要的突变基因等数据，做做比较，找找数据的相关性，揭示共同点与不同点，文章的价值会增加不少。
2）缺乏机制的关联，这里仅关联了通路，没有深入到通路内部，揭示蛋白与底物等关系对，如果能找到一两个核心的通路或者机制（来源文献），整理一下激酶与底物的关系，概括出磷酸化的变化是哪些激酶作用的结果，及该变化可能会引起的信号轴的变化，提出一个信号轴，该文章的价值会得到极大的提升。
3）蛋白质谱与磷酸化的关联较少，这里提到了两点，应该重点讨论，两者是如何共同发挥功能的，是否有蛋白未改变，而磷酸化改变的这样的蛋白。是否可以讨论呢，总之可以分析讨论的地方很多....
