1. 技术产生背景
PacBio构建这种文库的一个主要原因是，在其测序芯片中有很多零模波导孔（ZMW），每个孔在测序时只能测一条DNA分子，这样其测序通量就受到孔数和文库长度的限制。近些年PacBio确实也在不停的增加ZMW孔的数目，从而来提升通量，ZMW孔的数目也从刚开始的3千个，一路增加到15万个、100万个和800万个，即将在2023年上市的Revio机型，单个芯片会包含2500万个ZMW孔。
当然这对于DNA分子较长的文库，和所需测序数据量较高的项目来说没有什么影响。但是实际中像细菌16S项目，全长的16S也只有1.5kb，或者转录组文库，反转录后的DNA分子长度平均也就1.5-2kb左右。就目前测序的酶读长，对于HiFi 15kb的文库数据，平均测序准确性可以达到QV30左右，即千分之一的错误率。如果文库较短，虽然可以获取更多的pass数，经过CCS矫正后具有较高的准确性，但是分子长度较短会使有效数据量变少，所以MAS-seq应运而生。
2. 文库构建过程
MAS-seq文库构建原理简单介绍如下：
- 构建样本的短片段文库，并将其平均分为多个独立的子文库，下图1是一个单细胞转录组文库构建过程，它分为了4个独立的子文库；
- 在每个文库中两端添加不同的接头，例如cDNA1文库的5'和3'分别添加AB接头，cDNA2文库的DNA分子5‘和3’分别添加B'C接头，cDNA3添加C'D接头，cDNA4添加D'E接头。再将这四个文库混成一个文库，由于BB'、CC'、DD'反向互补，连接生产一个较长片段文库；
- 目前PacBio官方提供8个子文库接头试剂盒，在15kb片段长度时就可以HiFi文库可以得到较高测序质量的数据，那么平均子文库的长度长度15/8约等于2kb；
3. MAS-seq数据拆分
PacBio测序仪可以支持Subreads类型下机数据和HiFi类型下机数据。两者之间的区别是，HiFi数据是将同一个ZMW孔中相同分子多次测到的Subreads经过合并纠错后生成的，具有较高的准确性，这一步转换称为CCS过程。在实际项目中，建议和服务商要求提供HiFi数据，因为这一转换过程非常消耗CPU资源。在CCS过程中，软件是不会去除MAS-seq数据中的接头序列的。为了将接头去除，获取实际DNA分子的碱基序列，可以使用软件Skera。拆分后的数据通常称为Segmented reads.
5. 演示
官方提供了一组MAS-seq文库结构的HiFi数据，我们可以拿过来学习，了解具体的输入和输出数据格式，以及Skera软件的用法。
# download HiFi reads for MAS-Seq PBMCs run on Sequel IIe
wget https://downloads.pacbcloud.com/public/dataset/MAS-Seq/DATA-SQ2-PBMC_5kcells/0-CCS/m64476e_220618_014917.hifi_reads.bam
# download MAS adapter fasta
wget https://downloads.pacbcloud.com/public/dataset/MAS-Seq/REF-MAS_adapters/MAS-Seq_Adapter_v1/mas16_primers.fasta
# run skera split to generate segmented reads
skera split m64476e_220618_014917.hifi_reads.bam mas16_primers.fasta segmented.bam
其中mas16_primers.fasta为包含adapter序列文件，文件中接头序列的存放顺序，必须按照多个小片段文库连接生成最终长片段文库中，adapter从5‘到3’的顺序存放。
4. 输出文件
skera split 运行完成后会生成很多文件，它们包含不同信息。
| 文件名称 | 内容说明 |
|---|---|
| segmented.bam | 去除adapter后的测序数据 |
| segmented.non_passing.bam | 两端adapter不合理的序列 |
| summary.csv | 去除adapter后数据的统计信息 |
| ligations.csv | 5'和3'不同adapter组合的统计 |
| read_lengths.csv | HiFi数据和Segmented reads长度统计信息 |
*summary.csv 输出文件格式说明:
Input Reads,2622891 #输入HiFI数据的总reads数吗
Segmented Reads (S-Reads),40131832 #被分割后得到segmented Reads总数
Mean Length of S-Reads,672 #segmented reads平均长度
Percentage of Reads with Full Array,86.3247 #拆分时一条HiFi reads得到的segmented reads数与文库设计一致的比例，本实例中包含15个segmented reads的HiFi reads数目占输入条数的比例
Mean Array Size (Concatenation Factor),15 #文库构建时完整HiFi reads理论包含segment数目
拆分数据时只输出按照adapter顺序连接的segment reads，例如官方提供的测试数据包含16个adapter，按照1-2，2‘-3，3’-4 ... 15‘-16 的方式加入到小片段文库中，然后通过2-2‘，3-3’ ... 15-15'粘性末端连接的方式将15条segment reads连接成一条长序列用于测序。由于在小片段文库中添加adapter是独立的，所以不应该产生1-3’、3-6‘这样连接方式，在拆分时也不回输出，下例中可以看出顺序连接的数目也是最多的。
sed 's/,/\t/g' m64476e_220618_014917.skera.ligations.csv|sort -k3,3rn | awk '{sum+=$3;print $0,sum}'|less -S
1 2 2579711 2579711
2 3 2569629 5149340
3 4 2555360 7704700
4 5 2548285 10252985
5 6 2535822 12788807
6 7 2522046 15310853
7 8 2509664 17820517
8 9 2502244 20322761
9 10 2495860 22818621
0 1 2494407 25313028
10 11 2490646 27803674
11 12 2486362 30290036
12 13 2481755 32771791
13 14 2478636 35250427
14 15 2475053 37725480
15 16 2406352 40131832
#只输出上面连接的segmented reads
2 4 8220 40140052
7 16 3157 40143209
6 16 2915 40146124
1 3 2885 40149009
5 16 2327 40151336
...
...
segment.bam文件中包含去除adapter的数据，Skera还会在每个序列后面添加很多tag以表示不同的信息。
| BAM tag名 | 类型 | 含义 | 举例 |
|---|---|---|---|
| di | i | segment的编号 | di:i:0 |
| qs | i | segment在原始HiFI数据中的起始位置 | qs:i:16 |
| qe | i | segment在原始HiFI数据中的终止位置 | qe:i:450 |
| dl | i | 5'端adapter在adatper fasta文件中的索引 | dl:i:0 |
| dr | i | 3'端adapter在adapter fasta文件中的索引 | dr:i:1 |
| ds | b | binary json，用于将segment还原为HiFi数据 | ds:b:10,21,23 |
另外，被分割生成的segment reads可以反向生成连接到一起的HiFi数据，由于去掉了非顺序连接的segments reads，所以生成的undo bam会比原来的小：
skera undo *.skera.bam *undo.bam #undo bam就是反向生成的HiFi数据的bam
