今天分享一篇关于在棉花上利用单细胞解析纤维发育的文章。
近期，Plant Biotechnology Journal在线发表了华农题为“Single-cell RNA-seq reveals fate determination control of an individual fiber cell initiation in cotton (Gossypium hirsutum)”的论文。这项工作首次在单细胞水平解析棉纤维分化起始调控网络及机制，提供了涵盖纤维细胞起始及早期伸长过程（纤维细胞分化、扩散生长和极性生长）的全基因组规模的基因表达图谱，并提出了单个纤维细胞早期发育的分子调控模型。
先看一下这个文章的材料选择和实验设计方案：
材料选择的是突变体系Xu142_LF，这个突变体是以陆地棉Xu142及其光子突变体Xu142 fl为亲本进行杂交获得了。其中突变体系选取的时期是纤维起始发育的4个阶段，分别是开花前1.5、1、0.5天和开花当天。总共6个样品。
下图a-d显示的是ovule epidermis在显微镜下面四个时期的表型状态。图e显示的是纤维起始细胞的数目。图f显示的是不同时间点的纤维起始细胞数目。g-j是纤维起始细胞在显微镜下的细节展示。最后得出结论epidermal cells（表皮细胞）是从-0.5天开始伸展或者突出的。
然后，利用单细胞转录组测序，从纤维起始4个阶段（开花前1.5、1、0.5天和开花当天），一共6个样本的胚珠外珠被中共鉴定出14,535个细胞。过滤完后，获得7529个细胞。对于富含纤维细胞的Xu142_LF 0天的单细胞样品，共获得3679个细胞，过滤完剩下1703个细胞。
为了衡量scRNA-seq的准确性，把LF_0 DAP的样品和以前的RNA-seq进行了对比，发现原生质体的过程一共诱导了3974个差异表达的基因。然后对于剩下的1703个细胞进行UMAP和t-SNE聚类后，可以分为9类（下图a/b）。然后利用已报道的纤维相关的marker基因，例如：MYB25，MYB25-like，MML4，MML9，HD1，HOX3。发现这几个marker基因基本都在cluster 5中表达（下图c）。
然后鉴定了各个cluster相关的marker基因（上图d）。基于marker基因表达模式分析和RNA原位杂交结果，将这些细胞定义为3个主要的细胞类型，即纤维细胞、非纤维表皮细胞和外色素层细胞（上图e）（说实话，没看懂怎么分成这三类的，当然我对棉花也不熟悉，可能根据形态学上的特征）。下面是3个marker基因的定位结果。
然后，作者对Xu142和突变体Xu142 fl胚珠的scRNA-seq数据进行比较分析（下图a/b）。从图中可以看出，fiber相关的cluster 4是只在Xu142中出现，而突变体fl中则没有。三个纤维相关的marker基因：MYB25,MML9,HOX3也是同样的规律（下下图）。
然后作者又比较了LF_0dHE Xu142_0d之间的差异。发现两个品种里面fiber相关的marker基因相似度很高，从overlap可以看出（下图e）。marker基因富集的pathway如上图c所示，其中highlight了一部分的TFs。
为了探索纤维细胞的分化和发育过程，作者合并了-1.5, -1, -0.5, 0四个时间点的样品共5137个细胞（我看附表数据应该是5326，不知道原因在那里）进行聚类，可以分成6类（下图a）。从结果来看，-1.5DPA的时候是没有纤维细胞的，所以说明纤维细胞可能是从-1 DPA开始分化，并且随着时间逐渐增多。
然后，作者尝试探索纤维细胞的分化过程。挑了-1， -0.5， 0时期共226（下图b）个纤维细胞进行了重新聚类（下图c）。聚类结果可以看出-1时期的纤维细胞主要在cluster 5.2。纤维细胞的发育轨迹分析显示，纤维起始可以细分为几个连续但特征明显的过程。胚珠表皮细胞在-1.5 DPA（开花前一天半）时有部分细胞处于前体纤维细胞状态，前体纤维细胞在-1 DPA时分化为纤维细胞，随后开始扩散生长（diffuse growth），在-0.5 DPA时开始突起，然后0 DPA时从转录水平上开始向极性生长（tip-biased diffuse growth）转变（下图d）。其中关键的marker基因：MYB25-like，MYB25,MML4在分支的开始阶段高表达。但是，HD1基因则在整个过程中均有表达。然后作者探索了分支1和分支2关键的节点基因，共发现了167个（下图f）。并分析了不同cluster功能的差异。接着highlight并且验证了个别的基因，例如：LTP1，E6等。
然后，作者对于这4个单细胞样品的数据（-1.5、-1、-0.5、0 DPA）进行了权重基因共表达网络分析（WGCNA）。按转录因子对网络中的基因进行过滤，分别得到四个阶段参与纤维起始的转录因子调控网络，从而揭示了这些过程中分别发挥作用的核心转录因子的时空表达模式。
其中MYB25-like 在-1 DPA开始高表达，CRISPR转基因实验证明该基因决定纤维分化；HOX3 在0 DPA开始高表达，转基因实验证明该基因并不影响纤维分化与突起，但决定纤维细胞能否极性生长。此外，对表皮特异因子PDF2的CRISPR验证表明其功能缺失导致0 DPA胚珠表皮突起细胞数量显著减少（下图）（不了解棉花，不确定这2个转录因子以前验证过这方面的表型没）。
结合纤维细胞发育轨迹分析、TF调控网络以及网络核心因子的功能验证，作者提出了一个基于单细胞水平的纤维起始模型。单个纤维细胞依次经历细胞分化、扩散生长和极性生长的过程，每个过程由不同的核心因子调控（整体来看，故事挺完整的一个文章）。
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