作者，Evil Genius
2026年空间转录组系列课程已经在进行中，各位学员上完课程后，课程上提到的文献一定要亲自看一看，提供给大家的脚本亲自做一做，遇到问题群里随时答疑。
今天我们来汇总一些空间平台解析肿瘤内部异质性。
核心问题：肿瘤内异质性 (ITH)
定义：单个肿瘤内存在多种多样的癌细胞状态、基因型和微环境生态位。
重要性：是治疗耐药和疾病进展的主要驱动因素。
本质：肿瘤是长期进化、突变累积和克隆选择的结果；是一个包含癌细胞、免疫细胞和基质细胞的动态、可塑的生态系统。
技术演进
古典病理学：首次发现组织学异质性。
DNA测序：提供分子层面的ITH见解，揭示克隆性肿瘤发生。
单细胞基因组学：以前所未有的粒度识别新细胞亚型和状态。
局限性： 这些方法需要组织解离，丢失了关键的空间位置信息。
解决方案：空间生物学的出现，因为细胞行为受空间组织控制。
空间蛋白质组学 (SP)
原理： 基于抗体检测（类似IHC/IF），但具备高度多重检测能力（可同时检测50-100个标记物）。
三大类别：
多重IHC (mIHC)：
方法：连续染色、成像、抗体剥离/失活循环（如MICSSS）。
优势：使用标准明场显微镜，兼容FFPE组织。
局限：循环次数有限（~20轮）。
多重IF (mIF)：
方法：
循环法：迭代染色、成像、失活（如CyCIF, t-CyCIF, IBEX, seqIF, MACSima）。
一次性法：使用DNA条形码抗体，通过多轮杂交和成像解码（如CODEX）。
优势：单细胞分辨率，更好的多重能力（40-100+蛋白）。
仪器示例：CODEX, Cell DIVE, PhenoCycler, Orion, MACSima, COMET。
基于质谱 (MS)：
方法：使用金属同位素标签，通过质谱检测（如IMC）或离子束成像（如MIBI）。
优势：无光谱重叠，背景低，高分辨率。
局限：仪器昂贵且需专业知识，扫描面积/速度有限，通常需要冷冻或固定冷冻组织（IMC/MIBI I）。
选择依据： 取决于实验需求、组织类型（FFPE vs 冷冻）、预算、通量和分辨率要求。
空间转录组学 (ST)
核心挑战： 在检测RNA的同时保留其空间位置信息（RNA测序通常需要组织裂解）。
四大类别：
显微切割/ROI-based (基于感兴趣区域)：
方法：使用激光或光控技术分离特定区域RNA（如GeoMx DSP, Light-seq, ZipSeq, TIVA, PIC）。
特点：非单细胞分辨率，提供选定区域内的全转录组或靶向数据。
基于荧光原位杂交 (FISH)：
方法：使用多轮荧光探针杂交、成像和剥离来解码RNA（如seqFISH, MERFISH）。
商业平台：Vizgen MERSCOPE (MERFISH), Nanostring CosMx (smFISH)。
特点：真正的单细胞/亚细胞分辨率，灵敏度高，但基因数量受光学拥挤限制（目前~1000-6000个基因）。需要预选基因组合。
新方法：RAEFISH 通过RCA扩增，实现全转录组覆盖，但灵敏度可能有折衷；PRISM 利用强度区分条形码，降低设备要求。
基于原位测序 (ISS)：
方法：在组织原位对RNA进行测序（如STARmap, BaristaSeq, ExSeq, FISSEQ, Xenium）。
特点：直接读取序列信息，单细胞/亚细胞分辨率，但同样受光学拥挤影响，基因通量有限。
基于空间条形码 (Spatial Barcoding)：
方法：使用带有位置条形码的探针阵列捕获mRNA，通过测序将转录本映射回空间位置（如Visium, Slide-seq, HDST, Stereo-seq, DBiT-seq）。
商业平台：10x Genomics Visium。
特点：全转录组覆盖，流程与现有测序兼容，无需专用成像设备。但非单细胞分辨率（每个点可能包含多个细胞），最新版本（Visium HD）接近单细胞。
空间功能基因组学
目的： 将基因型（扰动）与表型（空间位置）直接关联，实现反向遗传学（从基因到功能）。
方法： 结合CRISPR筛选与空间读数。
基于蛋白质读数 (SP-readout)：
使用蛋白条形码（如Pro-Codes, EpicTag, EPICode）标记携带特定sgRNA的细胞。
通过抗体染色检测条形码和表型标记物。
关键方法：Perturb-map。应用：发现TGFBR2缺失、IL-4、CCL7、PAI1/2等基因在肿瘤微环境重塑和免疫逃逸中的作用。
基于转录组读数 (ST-readout)：
在ST平台上直接检测sgRNA或扰动引起的转录组变化。
关键方法： Perturb-FISH (MERFISH), Perturb-Multi (CROPseq-multi + MERFISH/ISS), CRISPRmap (seqFISH), PerturbView (ISS), Perturb-CAST (Visium), Perturb-DBiT (DBiT-seq)。
空间克隆追踪
目的： 重建肿瘤内不同克隆谱系的进化历史和空间分布。
方法类别：
利用内源性体细胞突变：
方法：显微切割+测序，Slide-DNA-seq，Slide-tags。
优势：适用于人类临床样本（无需工程改造）。
特点：Slide-tags可实现单细胞核分辨率的空间转录组/表观基因组分析。
利用工程化条形码：
整合酶系统 (intMEMOIR)： 通过DNA重组记录谱系，可结合FISH。
慢病毒条形码 (TREX, SpaceBar)： 随机序列标记细胞，可结合ST。
利用CRISPR诱导的“疤痕”：
原理：诱导Cas9在条形码上产生随机突变（插入/缺失），形成独特标识。
方法：scGESTALT, ScarTrace, LINNAEUS, macsGESTALT, iTracer, Zombie。
关键应用 (macsGESTALT)： 在胰腺癌中发现，大多数克隆不转移，而获得杂交EMT状态和表达S100基因的罕见克隆具有转移能力。
综合模型： 如KP-Tracer（结合CRISPR疤痕和ST），用于研究肺癌进展中的空间群落和克隆动态。
