最近一直在跑PCR，利用2(-Delta Delta C(T))次方的方法对目的基因进行相对定量，来比较野生型和基因敲除小鼠样本中的表达差异。
我们都知道有一对好的引物，对实验的顺利进行起着至关重要的作用。由于要检测的基因比较多，师姐就让我统一在文献中找引物。按理来说，文献中给出的引物是已经验证过的，大概率会比较好用，但实际情况是在我们的样本中有些引物的Ct值＞35，或者存在双峰的情况（引物特异性不好），因此厌倦了反复搜文献的科研汪开始了设计引物之旅。
基于既往的经验和百度来的信息，总结了一下的方法进行引物设计。
1.查找发表的文献：这个是最偷懒的办法，但需要注意文献中是否有特殊的实验设计，如引物是针对特定序列的或引物是转录本特异的等情况。
2. 使用生工网站上的免费引物设计：确定实验方法，在Nucleotide中找到目的基的基因ID，然后提交等待结果，如果之前有人在网站提交过，提交的同时就能看到结果，如果没人提交过，一般需1-2个工作日。
3.利用软件（Primer Premier或oligo）进行引物设计：
进入NCBI的Nucleotide数据库→确定目的基因的转录本，找到CDS区—设置引物参数—利用NCBI BLAST进行引物验证—找公司进行合成。
方法1、2简单易操作，适用于科研小白入门；方法3比较繁琐，但好处是来源清晰，且所有参数都是由自己设置，适用于有一定经验的科研工作者。
小知识：
1. 引物设计的基本原则：
a.产物不能形成二级结构。
b.引物长度一般在15~30碱基之间。
c.G+C含量在40%~60%之间。
d.碱基要随机分布。
e.引物自身/引物之间不能有连续4个碱基的互补。
2. 常见导致引物二聚体的因素：
a.引物序列互补。
b.高循环数（>35）。
c.掺入外源基因组DNA，引物结合靶 DNA 的效率低。
参考链接：
1. 引物设计常见问题：
https://baike.baidu.com/item/PCR%E5%BC%95%E7%89%A9%E8%AE%BE%E8%AE%A1/8121791?fr=aladdin
2. Nucleotide：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/
3. Primer Premier：
https://blog.csdn.net/weixin_39825872/article/details/111266076?utm_medium=distribute.pc_relevant.none-task-blog-2%7Edefault%7EBlogCommendFromBaidu%7Edefault-5.no_search_link&depth_1-utm_source=distribute.pc_relevant.none-task-blog-2%7Edefault%7EBlogCommendFromBaidu%7Edefault-5.no_search_link
4. Oligo：http://www.360doc.com/content/20/0827/11/71281349_932458264.shtml
