1.什么是生物胁迫和非生物胁迫？
植物不同于动物可以自由的行走或者飞翔，选择合适的生产环境，而是固着在土地上，不可避免的遭受来自环境中恶劣条件的侵袭。根据不利条件的类型，将环境胁迫可以分为生物胁迫和非生物胁迫。
生物胁迫是指对植物生存与发育不利的的各种生物因素的总称。
非生物胁迫是由非生物因素造成的不利影响，主要有水分（干旱、淹涝）、温度（高温、低温）、盐碱、环境污染（重金属、农药等）等理化逆境。
2.什么是抗逆基因？
植物中有些基因会对胁迫进行响应，从而降低胁迫对于植物生存和生长发育产生的影响，也就是抗逆基因。
当植物受到逆境胁迫时通过细胞信号转导引起基因表达调控，导致大量蛋白质表达变化，从蛋白质水平研究植物适应逆境胁迫的分子机理具有重要意义。
3.酵母抗逆基因筛选服务能达到什么效果？
酵母是一种单细胞的真核生物，在培养基上可以快速生长。酵母菌和植物的表达系统更为接近，也具有糖基化、二硫键形成及蛋白质折叠、翻译后加工等过程，从而使得筛选出的植物基因所编码的蛋白功能正常发挥，验证的逆境抗性基因假阳性的概率大大降低。
利用酵母菌，在逆境筛选系统下，通过抗性梯度实验对基因组范围内的抗性相关基因进行筛查，利用蛋白组学寻找候选蛋白，进行蛋白水平上的表型验证。
4.酵母逆境文库构建技术路线
通过对不同的生长时期、不同组织部位采样，提取RNA，获得高覆盖率cDNA文库，将cDNA文库与接头连接，形成三框文库，通过均一化处理有效降低基因的冗余，富集低丰度表达基因，运用SMART技术连接在pYES 2-NTB载体上，将获得的cDNA文库电转化至大肠杆菌感受态细胞中进行克隆扩增，文库质检和质粒提取，鉴定文库质量，NGS测序，确定文库所含序列。
5.酵母逆境文库筛选技术路线
制备酵母工作菌液，将cDNA文库转化于环境敏感性的酵母菌株，菌落PCR验证鉴定工作菌液质量，同时设置阳性和阴性对照组，通过配置逆境筛选条件5个不同浓度的培养基（逆境条件摸索），确定逆境条件，在上述条件下，涂布20个15ml平板，提取96个阳性克隆进行菌落PCR并一代测序，与GenBank数据库序列进行BLAST比对分析，回转验证，NGS测序，数据整理分析，并进行GO+KEGG分析。
6.抗逆基因表型验证
目的基因合成，构建到pYES 2-NTB载体，构建成功的载体转化环境敏感性酵母菌株，同时设置阴性对照组，梯度稀释点板，逆境条件实验，判断目的基因是否抗逆。
案例展示：验证基因A是否能提高酵母菌株Δycf1的耐镉能力。
实验结果：空载对照组在0uM、40uM、50uM、60uM CdCl2在SG-U条件下可以生长，在80uM、100uMCdCl2的SG-U条件下不可以生长。实验组在0uM、40uM、50uM、60uM、80uM、100uMCdCl2的SG-U条件下可以正常生长。
结论：pYES 2-NTB-A提高了酵母菌株Δycf1的耐镉能力
7.Q&A
（1）利用酵母进行基因抗性的筛选或验证可靠性如何？
答：酵母是一种真核生物，其表达体系与植物相近，也具备糖基化、二硫键形成及蛋白质折叠、翻译后加工等过程，从而使得筛选出的植物基因所编码的蛋白功能正常发挥。目前酵母在众多研究文献中被用于抗逆基因的筛选和验证。
但是作为异源体系，酵母中的验证结果只能为研究提供证据支撑，不能以酵母验证结果作为基因抗性验证的唯一体系，需要配合其他体系共同为该基因研究提供证据。
（2）酵母逆境文库如何构建？
答：和酵母单杂、酵母双杂类似，酵母逆境文库也可以利用SMART、Gateway方法构建，只是载体存在区别。因此在有Gateway初级文库的情况下，可以通过亚克隆得到逆境文库，降低构建成本。
