酵母文库构建和筛选服务-宝吉生物

2009-，15年+文库构建和筛选经验，专业的文库构建和筛选供应商。

1.酵母文库构建

上海宝吉结合多年的文库构建经验，强势推出“All-Direct”文库构建技术，我们的产品较其他构建方法（主要有takara的SAMRT方法和invitrogen的gateway方法），技术和质量上都具有较大的优势。

一、产品质量标准

关于我们的文库构建产品，我们承诺的指标如下:

原始文库库容量大于1*10^7CFU；

平均插入片段大于1200bp ；

克隆阳性率大于95%。

二、技术特点与技术优势:

1.我们是采用同源重组的方法构建文库，没有经过任何的内切酶切割和连接过程，确保不会出现基因被酶切切断的情况，能够保证基因的完整性，而Clonetech的是用酶切连接的方式构建的。

2.由于我们采用的是重组的方式把cDNA重组到载体上，相对clonetech的SMART的T4连接酶的方法效率要高的多，我们承诺原始库的库容量在1*10^7以上。而且重组的方式假阳性很低，我们这里有的客户一次测3万个克隆，都没有出现一个空载的情况，我们承诺阳性率大于98%，这是酶切连接的方法远远无法比拟的。

3.Clonetech的SMART方法是用PCR的方法合成第二链的，由于PCR的选择性抑制及竞争性扩增，这样就会造成基因冗余度非常高，低丰度的基因PCR扩增不到，会丢失掉，长片段的基因也会丢失掉，另外会造成重复序列非常多，特别是起始的RNA样本量少的情况（比如5ug RNA以下就需要进行15个循环以上的PCR扩增，大大降低文库质量),，大大降低文库包含的基因数量，而我们的cDNA合成方法是用多种酶在16度恒温的条件下直接合成第二链的，这样就忠于样本自身的基因情况，不会人为的改变样本内的基因情况以及基因大小，大大提到文库的质量。

4.我们是采用的一种高质量的反转录酶，较clonetech的反转录酶具有反转录温度高（55摄氏度反转，clonetech的反转录酶是使用42度反转，较高的温度可以打开RNA的二级结构，可以获得更长的cDNA），反转录效率和cDNA长度要好的多。我们承诺文库的平均插入片段在1.3Kbp以上，短的长度也在1Kbp以上，而clonetech的SMART方法构建出来的文库一般只有几百BP。

文库构建流程:

1.RNA提取

2.mRNA提取

3.cDNA的酶促法合成（使用酶促法直接合成，不经过PCR扩增过程，比SMART方法质量大大提高）

4.cDNA连接接头

5.cDNA按长度分离

6.cDNA与酵母双杂交文库载体(pGADT7或者pDEST22)进行all-direct重组

7.重组产物电转化

8.文库检测以及质粒提取

2.酵母双杂交文库筛选：

1）核蛋白酵母双杂交文库筛选技术服务（可以选择使用invitrogen的pDEST22和clonetech的pGADT7两套系统进行筛选，可以使用预制商业化文库或者本公司定制构建的酵母杂交文库）

1.实验原理

蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(BindingDomain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain,AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA系统和Gal4系统两种。在LexA系统中，DNA结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在Gal4系统中，BD和AD分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa与768-881aa)构成。在利用GAL4系统筛选cDNA文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA结合结构域与靶蛋白即"诱饵"相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD可以与GAL4上游活化序列（GALUAS）结合但不能引起转录，单独的AD则不能与GALUAS结合，只有当BD与AD分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD与AD才能与GALUAS结合并且引起报道基因的转录。在BD与AD要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs和启动子的下游构建了3个报道基因--ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。GAL4系统的原理如图所示

酵母双杂交系统工作原理

2．系统特点

同以往研究蛋白质-蛋白质之间相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有其独特优势。首先，融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行，蛋白质有可能保持天然的折叠状态，类似其在体内生理状态下的情况，这是其他离体生化检验方法所缺乏的，因此较之后者，它所证实的蛋白质间相互作用将更接近于在体的真实水平。其次，双杂交系统的敏感度即高，可以检测到在蛋白质之间结合常数低至1mmol/L 左右的微弱作用。许多微弱或短暂的蛋白质之间的相互作用可以借助报道基因表达过程中的多级放大效应反映出来；融合蛋白基因在强启动子的作用下，处于较高的表达水平。第三，在筛选cDNA 文库时，双杂交系统能够简捷地得到编码相互作用蛋白的基因序列，它只需构建质粒而不必准备抗体或纯化蛋白，省略了其它体外检测蛋白之间相互作用方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。

需要指出的是，融合体蛋白必须转运至核内才能活化转录，因此对于胞外配体-受体作用以及需要核外修饰或受磷酸化等翻译后修饰过程介导的蛋白质间相互作用而言，该系统的应用受到一些限制。在进行文库筛选时，假阳性结果常常干扰实验的准确性，除某些文库编码的蛋白质本身含有转录活化成分外，细胞内的其它无关蛋白也可能有类似作用，因此双杂交系统检测的结果必须通过其它蛋白间相互作用的实验来进一步验证。

3. 我们的工作内容

您只需提供用于筛选的诱饵质粒信息，我们会完成整个的筛选工作，主要包括以下内容：

3.1 诱饵载体的构建

3.2 诱饵质粒的自激活检测

3.3 文库质粒和诱饵质粒共转酵母感受态细胞

3.4 文库筛选和3AT优化

3.5 文库筛选结果测序分析

3.6 筛选结果回转验证

3.7 详细报告的整理和数据发送

4.交付结果

提供详细的、完整的实验报告，清晰的实验图片，筛选结果的测序结果，质粒等。

5.服务报价

3 万元整，现9折促销，即：2.7万元。

6.服务周期

80个工作日

2）膜蛋白酵母双杂交文库筛选技术服务（使用DUALmembrane 技术系统）

1. DUALmembrane 技术原理

DUALmembrane 技术在传统的酵母双杂交系统的基础上，巧妙地利用分离的泛素系统（split-ubiquitin）进行跨膜蛋白相互作用的筛选。

分离的泛素系统（split-ubiquitin）泛素可以人为分成两部分：N 端（Nub），C 端（Cub）。

正常情况下，Nub 和 Cub 仍具有很高的亲合力，表现出野生型泛素的功能，即仍发挥降解蛋白质的信号功能。

那么如何将泛素系统和酵母双杂交融合成一体呢？

首先，人为地将泛素 Nub 的 3 位异亮氨酸突变为甘氨酸（NubI 突变为 NubG）。这样与 Cub 的亲合力大大降低，避免了 Cub 和 Nub 自我结合或接近的可能性；。

其次，将 Cub 部分与人工合成的 LexA-VP16 转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。因此正常条件下 NubG 不与 Cub 结合，UBPs 也不能识别分离的泛素，转录激活因子也不会被切下来。最后，将要检测的蛋白质分别与 NubG 和 Cub 融合，形成 bait 融合蛋白（bait-cub-LexA-VP16）和 prey 融合蛋白（prey-NubG）。如果 bait 和 prey 发生相互作用，就会促使 NubG 和 Cub 的相互接近，从而得到重构，被 UBPs 识别，导致 LexA-VP16 的解离，进入核内，从而激活报告基因的转录。