1. 样品元基因组提取
1.1 样品元基因组抽提核心思想：
尽可能多的获得样本中各种微生物的基因组DNA。
1.2 样本元基因组提取的重要性：
最大程度获得样本中各种微生物的基因组DNA，为后续样本的分析和比较提供完整的微生物种类及丰度信息。否则，分析环节“形同虚设”，永远分析不出真实结果。
1.3 对样品的一些思考：
a）样本收集的难易程度；
b）样本的珍贵程度；
c）怎样用尽可能少的单个样本使用量来帮助客户完成研究目的；
d）怎样在实验开始前就确保客户结果的准确性；
e）复杂环境中的样本基因组如何能够更全面的获取。
1.4 元基因组提取的主要原理（核心步骤）：
①通过高温化学裂解法和物理击打法充分裂解细胞；
②离心法除去杂质、抑制物等；去除破碎细胞中的蛋白质；
③纯化DNA；
④消化RNA。
1.5 元基因组提取的主要流程：
1）样品准备：
样本-80℃保存；
避免样本出现反复冻融，影响样本中微生物组成，样本均在冰盒或干冰上完成拿取和转移。
2）化学裂解+物理击打
I.化学裂解：
作用：采用化学方式破坏细胞膜和细胞核膜充分释放细胞内容物。
II.物理击打：
作用：针对细胞膜难以裂解或裂解不充分的微生物，采用玻璃珠碰撞产生剪切力进行物理干预破坏；
材料：玻璃珠。
3）酚类及生物碱干扰物的去除
PVPP：
作用：
a）去除酚类和生物碱；
b）可参与配制适合的缓冲溶液反复浸提体系中的DNA，同时吸附杂质。
4）蛋白质、杂质、抑制剂干扰物的去除
HTR等试剂
纯化DNA；
Rnase A 消化RNA；
获得DNA溶液；
2. PCR文库扩增
2.1 高保真pfu酶的使用：
作用：
①降低扩增环节碱基错配率；
②校正作用；
③保真性大于Taq酶；
④产生平末端。
2.2 最低循环数的控制：
a）循环数对PCR扩增的影响：
1）降低扩增环节碱基错配率；
2）校正作用；
3）保真性大于Taq酶；
4）产生平末端。
b）解决方法：
1）根据样本来源及类型，利用预实验对扩增反应条件进行摸索，用最低的循环数获得满足后续实验浓度要求的扩增产物。
2）因样本间存在质量差异等情况，应保持每个样本扩增的循环数统一。
c）扩增DNA模板浓度的均一性
根据样本类型和来源，将扩增时样本DNA浓度调整至一致，以免由于样本DNA浓度差异造成扩增后产生偏差，增加样本间的可比性。
d）建库扩增循环数
1）采用扩增形式进行接头添加；
2）利用最低循环数确保完成建库。
3.实验过程质控
3.1 阴、阳性对照设置
1）元基因组提取环节：
①设置阳性对照，监控提取效果；
②设置阴性对照，监控提取流程。
2）PCR环节：
①设置阳性对照，监控扩增效果；
②设置阴性对照，监控PCR操作流程；
③扩增抽提环节阴性对照，监控抽提是否有污染；
④扩增抽提环节阳性对照，验证抽提效果。
4.数据分析优先级的确定
4.1 下机数据分析优先级：
1）分析阳性对照：观察实验、测序环节是否有问题；
2）比较分析不同测序run之间的阳性对照，排除测序批次间的差异性。
3）按照要求分析该批次中的样本。
