1. 利用macs2 callpeak进行 calling peaks，其中有个参数--keep-dup，这是如果输入为过滤掉重复reads的bam文件，这--keep-dup all。如果为未过滤重复reads的bam文件，--keep-dup 1。此参数是指定输入bam文件中重复reads有无的。
macs2 callpeak 的基本命令
-t
IP.bam
-c
input.bam
-g
genome.size
-B
输出bgd文件，下游bigwig文件生成所需
-f
双端测序使用BAMPE，单端的话不需要加参数（或 -f BAM），默认是auto识别。除”BAMPE”, “BEDPE”需要特别声明外,其他格式都可以用 AUTO自动检测。
标签文件的格式，可以是“ELAND”，“BED”，“ELANDMULTI”，“ELANDEXPORT”，“ELANDMULTIPET”（用于对端标签），“SAM”，“BAM”，“BOWTIE”，“BAMPE”或“BEDPE”。默认为“AUTO”，这将允许MACS自动决定格式。当您使用“AUTO”时也会使用
结合不同格式的文件。请注意，MACS无法检测到“BAMPE”或“BEDPE”格式带有“AUTO”，你必须隐含指定“BAMPE”和“BEDPE”的格式。
格式指定'BAMPE'或'BEDPE'时将触发特殊模式。这样，MACS2将处理BAM或BED文件作为配对结束数据。而不是建立双峰分布正负链读数预测片段大小，MACS2会使用读取对的实际插入大小来构建片段积累。（所以，当你的数据是双端测序数据时，你应该用BAMPE或者BEDPE参数。当你设置成双端参数的时候，MACS2就会跳过建模计算d的那一步，而是直接用片段的insert size来建立堆积。）
BAMPE格式只是包含配对末端对齐的BAM格式信息，例如来自BWA或BOWTIE的信息。
BEDPE格式是一种简化且更灵活的BED格式只包含定义染色体名称的前三列，来自Paired-end的片段的左右位置测序。请注意，这与BEDTOOLS使用的格式不同，BEDTO的BEDTOOLS版本实际上不在标准BED中格式。
-q
设置FDR阈值
-p
设置pvalue阈值
--nomodel
MACS 不构建模型。这个参数和extsize、shift是配套使用的，有这个参数才可以设置extsize和shift。
--extsize
当设置了nomodel时，MACS会用--extsize这个参数从5'->3'方向扩展reads修复fragments。比如说你的转录因子结合范围200bp，就设置这个参数是200。
--shift
当设置了--nomodel，MACS用这个参数从5' 端移动剪切，然后用--extsize延伸，如果--shift是负值表示从3'端方向移动。建议ChIP-seq数据集这个值保持默认值为0，对于检测富集剪切位点如DNAsel数据集设置为EXTSIZE的一半。
--SPMR
需要-B被设置，不影响FDR和pvalue
--outdir
输出文件的路径
--broad
peak有narrow peak和broad peak, 设置时可以call broad peak 的结果文件。
--broad-cutoff
和pvalue、以及qvalue相似
其实，这里面讨论最多的是--nomodel --shift -100 --extsize 200这些参数如何选择，下面的图很形象的展示了参数的作用。当然，我也是查阅了很多资料与文献，
一般默认在ATAC-seq，DNase-seq，FAIRE-seq的时候将shift设置为extsize的一半，且参数固定为：--nomodel --shift -100 --extsize 200 （猪项目中为shift -75 --extsize 150）。
而在MNase-seq的时候，参数固定为：--nomodel --shift 37 --extsize 73。
在ChiP-seq的时候不用移峰，所以只使用-nomodel！！当做组蛋白修饰的时候，由于peak并不典型，所以使用--nomodel --extsize 73参数。
对人细胞系ATAC-seq 数据call peak的参数设置如下：
macs2 callpeak -t sample.final.bam -n sample --nomodel --shift -100 --extsize 200 -B --SPMR -g hs --outdir Macs2_out 2 --keep-dup all --call-summits > sample.macs2.log (单端read时，bam已经去过重复则--keep-dup all，不去的话--keep-dup设置为1)
macs2 callpeak -t sample.final.bam -n sample -f BAMPE -B --SPMR -g hs --outdir Macs2_out 2 --keep-dup all --call-summits > sample.macs2.log（双端reads）
思考：-f 设置为BAMPE时，好像与--shift -100 --extsize 200 --nomode冲突，因为加不加这三个参数，结果是一样的。看-f里面，BAMPE的解释好像也是这个意思。
所以对于双末端数据可以只设置-f BAMPE与--nomode --shift -100 --extsize 200 参数二选一？？？
参考1：组蛋白ChIP分析要注意的2个要点（基迪奥）：https://www.genedenovo.com/news/333.html
–shiftsize已经被 –extsize所替代；（https://www.imooc.com/article/270403）
参考2: https://www.jianshu.com/p/e83a7e10ea2e?tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg
参考3: https://www.jianshu.com/p/9aa719faa4b5
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---------------------------------------------------------最近macs3说明书建议分析方法---------------------------------------------------------------------------------------
Examples:
1. Peak calling for regular TF ChIP-seq:
$ macs3 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam -f BAM -g hs -n test -B -q 0.01
2. Broad peak calling on Histone Mark ChIP-seq:
$ macs3 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam --broad -g hs --broad-cutoff 0.1
3. Peak calling on ATAC-seq (paired-end mode):
$ macs3 callpeak -f BAMPE -t ATAC.bam -g hs -n test -B -q 0.01
4. Peak calling on ATAC-seq ( focusing on insertion sites, and using single-end mode):
$ macs3 callpeak -f BAM -t ATAC.bam -g hs -n test -B -q 0.01 --shift -50 --extension 100
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---------------------------------------------------------------综上感觉对的应该是-------------------------------------------------------------------------------------------------------
1.分析普通转录因子时：
macs3 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam -f BAMPE -g hs -n sample -B -q 0.01 （双末端测序，--keep-dup all必须根据实际情况申明）
2.分析组蛋白ChiP时
鉴定方法1：（建议优选这个吧？？？）
Narrow peak： macs3 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam -n sample -f BAMPE -B -g hs -q 0.05 （双末端测序，--keep-dup all必须根据实际情况申明）
Broad peak：macs3 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam -n sample -f BAMPE -B -g hs -q 0.05 --broad --broad-cutoff 0.1 （双末端测序，--keep-dup all必须根据实际情况申明）
注：DNA methylation underpins the epigenomic landscape regulating genome transcription in Arabidopsis （GB论文），就用了这个方法鉴定peaks，但是-q和--broad-cutoff参数（-q 0.00001 --broad-cutoff 0.00001）更为严格，可以根据实际需求进行调整。
鉴定方法2（如基迪奥推荐方法，用--nomodel，--extsize 指定拓展值）
Narrow peak：macs2 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam -n sample -g hs --keep-dup all --nomodel --shift 0 --extsize 200 -q 0.01
Broad peak：macs2 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam -n sample -g hs --keep-dup all --nomodel --shift 0 --extsize 200 -q 0.01 --broad --broad-cutoff 0.1
注：A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input （nature cell biology），就用了这个方法鉴定peaks，但是基迪奥推荐方法推荐--extsize 73，《猪基因组顺势元件鉴定及功能SNP注释》，建议--extsize n，n由计算获得。
3. 分析ATAC-seq时
鉴定方法1：（建议优选这个）
macs2 callpeak -t ATAC.bam -n sample --nomodel --shift -100 --extsize 200 -B --SPMR -g hs --outdir Macs2_out 2 --keep-dup all --call-summits
注：但是--shift -100 --extsize 200这个所用论文极多，但是也有其他数值，如《猪基因组顺势元件鉴定及功能SNP注释》用的是shift -75 --extsize 150；macs3又推荐shift -50 --extsize 100；最新的Genomic innovation and regulatory rewiring during evolution of the cotton genus Gossypium （NG棉花论文）用的是—extsize 38 - shift -15（UMI-ATAC-seq），总体来说五花八门。
鉴定方法2：
macs2 callpeak -f BAMPE -t ATAC.bam -g hs -n sample -B -q 0.01
20240602更新：
在基因课最新的课程中
TF和组蛋白修饰：
进行双末端测序时，直接-f BAMPE；单末端测序，直接-f BAM，如果不能有效估计d值，在手动设置--nomodel --shift --extsize等参数
在ATAC-seq时：
建议-f BAM --nomodel --shift -100 --extsize 200
基本和我的建议一样。
