杂志：2024年3月《cell》 影响因子 45.6
题目：IGSF8 是先天免疫检查点和癌症免疫治疗靶点
单位： 上海寻百会生物科技有限公司
刘小乐教授团队非常精彩的一项工作，利用功能基因组 CRISPR 手段发现了新的 NK 细胞检查点，基于该新靶点研发的药物已经进入了临床一期，更证明了其商业价值。文章中各种组学生信分析和抗体工程技术信手拈来并相互印证，非常好的一篇学习文章
1 文章亮点
抗原呈递缺陷是肿瘤适应性免疫逃避和检查点抑制剂耐药性的常见机制，但缺失假说认为，NK 细胞应该清除存在 MHC-I 缺陷的恶性细胞。NK 细胞为何无法在存在抗原呈递缺陷的肿瘤中做到这一点尚不清楚。通过在与 NK 细胞共培养的恶性细胞中进行 CRISPR 筛选，本篇文章鉴定出了 IGSF8，这是一个此前未被发现的 NK 细胞检查点，它在恶性细胞中高表达，可抑制 NK 细胞介导的细胞毒作用。文章进一步开发了抗 IGSF8 的抗体，它可以增强NK细胞体外对恶性细胞的杀伤。并且抗 IGSF8 单独使用或与抗PD1联合使用可抑制体内肿瘤生长。该抗体的独特之处在于，它能够刺激 NK 细胞杀死存在抗原呈递缺陷和应激信号的恶性细胞，同时不影响 MHC-I 正常且无应激信号的正常细胞
背景知识及假说
1、CD8+ T 细胞通过主要组织相容性复合体 I 类 (MHC-I) 识别恶性细胞上呈递的肿瘤新抗原。T 细胞可以在识别肿瘤新抗原后杀死恶性细胞，但恶性细胞上表达的抑制分子通常会与 T 细胞相互作用，从而诱导 T 细胞功能障碍。目前的 ICB(Immune checkpoint blockade) 抗体可以阻断这种相互作用，并使处于早期功能障碍的 T 细胞恢复活力。
2、除了 T 细胞功能障碍之外，超过 65 % 的肿瘤都出现 MHC-I 缺失，这是对 ICB 治疗产生原发性和获得性耐药性的常见机制。MHC-I 丢失可能由于 DNA 突变、RNA 下调、表观遗传沉默或自噬引起的蛋白质降解而发生。这些抗原呈递缺陷的肿瘤无法被 T 细胞检测或破坏，因此通常 T 细胞浸润（T 细胞排斥）较低，被认为是“免疫冷”肿瘤
3、MHC-I 通常充当“自身”的标记，而缺乏 MHC-I 的细胞（例如由于病毒感染而导致的）会被自然杀伤 (NK) 细胞识别和杀死。考虑到 MHC-I 丢失的肿瘤的普遍性，文章着手解决癌症免疫学中的一个主要难题：为什么 NK 细胞不会杀死具有 MHC-I 缺陷的肿瘤？
CRISPR筛选原理
https://www.jianshu.com/p/308377fc7e09?v=1749198983098
2 摘要
1、利用 CRISPR 筛选，文章发现肿瘤上表达的 IGSF8 通过与 NK 细胞上的人 KIR3DL2 和小鼠 Klra9 受体相互作用来抑制 NK 细胞功能
2、IGSF8 通常在神经组织中表达，并且不是细胞在体内外存活所必需的。它过表达，并且与许多肿瘤中抗原呈递水平低、免疫浸润水平低和临床预后较差相关
3、阻断 IGSF8-NK 受体相互作用的抗体可增强 NK 细胞在体外对恶性细胞的杀伤力，并上调在体内抗原呈递、NK 细胞介导的细胞毒作用和 T 细胞信号传导
4、在同基因肿瘤模型中，单独使用抗 IGSF8 或与抗 PD1 联合使用均可抑制肿瘤生长。文章的结果表明，IGSF8 是一个先天免疫检查点，可以作为治疗靶点
3 结果
3.1 共培养 CRISPR 筛选鉴定出 IGSF8 为 NK 细胞检查点
1、基于以上信息，文章提出了假设具有 MHC-I 缺陷的恶性细胞会表达蛋白质来抑制 NK 细胞功能，从而逃避 NK 细胞的激活和杀伤。为了验证这个假设，文章使用了一个 MHC-I表达正常的 COLO205 人类结肠癌细胞系 和另一个 MHC-I缺失的 AGS 人类胃癌细胞系，进行了 NK 细胞共培养 CRISPR 筛选（使用慢病毒 CRISPR 敲除文库编辑细胞）
2、通过高通量测序测量了在有或没有 NK 细胞治疗的情况下编辑的 COLO205 或 AGS 细胞中的 CRISPR 引导的丰度，并通过 MAGeCK 算法识别了两种治疗条件下差异选择的基因
3、 CRISPR 基因的敲除会使肿瘤细胞对 NK 细胞杀伤更敏感（负向选择）。 COLO205 细胞系负向筛选到的是HLA-C,HLA-E 这些 MHC-I 家族成员， 而 MHC-I 缺陷的 AGS 细胞系负向筛选到的是 IGSF8 基因（Fig1B）。在之前发表的与 NK 细胞共培养的 K562 白血病细胞系的 CRISPR 筛选中，IGSF8 也表现出中等程度的负向选择（FigS1A）。但是 DepMap 项目在没有免疫细胞压力的条件下，生长的数百种癌细胞系上进行的 CRISPR 筛选表明，IGSF8 对癌细胞存活没有重大影响（Fig S1B,S1C）
4、在使用两种不同的 CRISPR gRNA 敲除 COLO205 和 AGS 癌细胞系中的 IGSF8，观察到了原代 NK 细胞杀伤能力显著增强（Fig1D,1E）
5、在共培养期间，K562 细胞中 IGSF8 的过表达显着抑制了脱颗粒标志物 CD107a 在NK 细胞上的表达，结果表明 IGSF8 通过抑制脱颗粒来抑制 NK 细胞介导的细胞毒性（Fig S1J，S1K）
6、IGSF8是一个进化上保守的基因，在人类和小鼠之间具有 90% 的序列同一性。小鼠 Igsf8 基因在两个已发表的 NK 细胞共培养 CRISPR 筛选中也表现出负选择
3.2 IGSF8 与特定 NK 受体相互作用，抑制 NK 细胞功能
1、IGSF8 蛋白通常与 PBMC NK 细胞具有较弱的相互作用（PBMC NK 是未经体外处理的原始 NK 细胞），但这种相互作用在 CRISPR 筛选的Expanded NK 细胞中显着增强(Expanded NK 是通过体外扩增和激活得到的 NK 细胞，数量多、杀伤力强)，如图 Fig2 A,Fig2 B
2、为了鉴定人类 NK 细胞上的 IGSF8 结合伴侣，我们采用了两种不同的方法。首先，我们对与 IGSF8 蛋白结合率低于 10 % 和高于 90 %的扩增 NK 细胞进行分选，以寻找可能导致差异结合的基因（目的是为了进行对照），如图 FigS2A。对FACS 分选的 Positive binding NK 和 Negative binding NK 细胞同时进行 RNA-seq，最终显示 KIR3DL2 是具有差异表达的顶级细胞表面受体，如图 Fig2C
3、使用 CRISPR 筛选也再次确认了 KIR3DL2 基因在NK细胞中的缺失会导致IGSF8与NK细胞的结合降低，如图 Fig S2C
4、使用SPR 验证了KIR3DL2-IGSF8 相互作用的亲和力为 0.654 μM，Fig S2D
5、IGSF8通过与KIR3DL2的特异性相互作用来抑制NK细胞介导的细胞毒性，FigS2M
6、小鼠 NK 细胞中不表达 KIR3DL2 ，相反，小鼠基因组拥有一个对应的受体基因家族 Ly49，其在功能和遗传特征上都与人类 KIR 家族非常相似，但在人类中没有表达。最终发现小鼠中只有 Klra9 蛋白能特异性结合 CT26-Igsf8 细胞
3.3 IGSF8 在多种癌症中表达水平较高，且与不良临床预后相关，IGSF8 与 KIR3DL2 的相互作用不依赖于 KIR3DL2 和 HLA 等位基因
1、在正常情况下，IGSF8 在脑和中枢神经系统中高表达，而 KIR3DL2 在脾脏和全血中表达，尤其是在 NK 细胞中高表达。如图FigS3A-3C。由于神经元几乎不表达 MHC-I ，IGSF8 可能通过抑制 NK 细胞有助于中枢神经系统的豁免
2、在 TCGA 中， IGSF8 mRNA 在黑色素瘤和许多实体瘤类型中显著过表达，如 Fig3A ; IGSF8 还显示出频繁的拷贝数扩增（FigS3D），这与 IGSF8 mRNA 表达呈正相关（FigS3E），表明它在恶性肿瘤细胞中表达。通过对96项 scRNA-seq 数据分析证实，IGSF8 在恶性细胞中的表达最高（Fig3B）
3、KIR3DL2在TCGA癌症样本中总体表达较低，拷贝数异常很少（FigS3F-3G）, 但是在但在NK细胞和T细胞中独特表达（Fig3B）
4、在 TCGA 数据库中， IGSF8 mRNA 的表达和与 CD8、颗粒酶、穿孔素、PDL1 和 B2M（MHC-I成员）呈负相关，如图Fig3。 通过分析 TCGA 数据库发现许多癌症类型中 B2M 频繁下调和 IGSF8 mRNA 表达上调，特别是在非小细胞肺癌和结直肠癌中(FigS3H 和 FigS3I)
5、在结肠癌中，恶性细胞与邻近正常上皮细胞相比，B2M 表达显著下降，IGSF8 表达上升。 MMRp（配修复功能正常 ）比MMRd（错配修复缺陷）的肿瘤上升更加明显
6、通过对公开数据的调查表明，在免疫浸润差、对细胞毒性敏感性低、抗原呈递缺陷和对抗 PD1 治疗有耐药性的肿瘤中，IGSF8 较高
7、为了评估 IGSF8 和 MHC-I 是否在蛋白质水平呈反向表达，文章检查了癌细胞系百科全书 (CCLE) 和临床蛋白质组肿瘤分析联盟 (CPTAC) 提供的蛋白质组学数据。IGSF8 mRNA 和 蛋白质水平在 CCLE 细胞系（FigS3K） 和 CPTAC 数据库的肿瘤呈显著相关（FigS3L）。但是，B2M 和 IGSF8 在 CCLE 细胞系和 CPTAC 数据库中没有明显相关性（FigS3M-S3N）,文章解释的可能原因是肿瘤基质细胞和免疫细胞上的 MHC-I 蛋白表达混杂所致。并通过免疫组化染色印证了这个方面。文章观察到了同一肿瘤样本中不同恶性细胞之间 MHC-I 和 IGSF8 蛋白的异质性和逆向表达（Fig3E）
8、文章进一步评估了 IGSF8 mRNA 表达与临床结果之间的关系。在 TCGA 数据库中的宫颈癌、结肠癌、非小细胞肺癌和黑色素瘤中，MHC-I 表达较低同时 IGSF8 表达较高，并且生存期较差（Fig3F 和 FigS4B）
9、在一项在 Pembrolizumab（K药） 治疗前已知肿瘤概况的黑色素瘤研究中，PD1 和 PDL1 的表达量无法区分药物应答者和无应答者，但完全应答者的 IGSF8 水平显著降低，B2M 水平显著升高（FigS4C）; 在另一项Nivolumab（O药）治疗前和治疗期间进行肿瘤概况的黑色素瘤研究中，收益组IGSF8 水平显著降低（Fig3G）。这些结果表明良好的抗原呈递和低 IGSF8 表达是抗 PD1 反应的信息预测因子和指标
3.4 阻断 IGSF8 与其 NK 受体的相互作用的抗体可以增强 NK 细胞的杀伤力
1、小鼠基因组数据库报告 igsf8 基因敲除小鼠仅有轻微的代谢和糖尿病表现，这表明通过抗体 block IGSF8 可能具有良好的耐受
2、文章开发了一种针对 IGSF8 的抗体 (IGSF8.06)，以阻断 IGSF8 与其配体的相互作用。Fig4 和 FIgS5 显示了该抗体药的一些性质，包括高亲和力、高特异性，并且能显著增强 Expanded NK 细胞对 AGS 和 COLO205 细胞的细胞毒性
3、这些结果表明 IGSF8.06 抗体通过阻断 IGSF8 与其 NK 受体的相互作用增强了 NK 细胞对恶性细胞的杀伤力
3.5 抗IGSF8抗体在体内具有显著的抗肿瘤作用
1、B16-F10同源肿瘤模型中测试了 Fc 沉默 IGSF8.06 抗体的体内疗效，具体表现为肿瘤生长抑制和小鼠存活率上升，如图 Fig5 和 FIgS6
2、IGSF8.06 与抗 PD1 联用时，在所有模型中，其疗效超过了单药治疗的完整剂量，生存期提升明显（Fig5F）
3、 KEGG 基因通路富集分析展示了 IGSF8.06 治疗与对照治疗相比，B16-F10（FigS5H）、LLC（FigS5I）、CT26（FigS5J）和 EMT6（FigS5K）肿瘤中上调基因，主要是增强了NK细胞介导的细胞毒性、抗原加工和呈递、细胞粘附分子以及T细胞信号传导
4 文章涉及到公共数据库
1 TISCH2 肿瘤微环境单细胞转录组分析工具（scRNA-seq）
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC9825603/
2 TCGA数据库(mRNA)
3 癌细胞系百科全书和临床蛋白质组肿瘤分析联盟（proteomics）
Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)
Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC)
4 小鼠基因组数据库
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC7779030/
5 参考文献
[1] Li Y , Wu X , Sheng C ,et al.IGSF8 is an innate immune checkpoint and cancer immunotherapy target[J].Cell, 2024, 187(11):38.DOI:10.1016/j.cell.2024.03.039.
