参考文献：
Aran, Looney, Liu et al. Reference-basedanalysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibroticmacrophage. Nature Immunology (2019)
SingleR是一个用于对单细胞RNA-seq测序（scRNA-seq）数据进行细胞类型自动注释的R包（Aran et al.2019），是基于表达值的correlation的。它通过给定的具有已知类型标签的细胞样本作为参考数据集，对测试数据集中与参考集相似的细胞进行标记注释。具体来说，对于每个测试细胞：
首先，我们计算每个细胞的表达谱与参考样品的表达谱之间的Spearman相关性。这是通过在所有标记对之间识别的marker基因的并集完成的。
其次，我们将每个标签的分数定义为相关分布的固定分位数（默认为0.8）。
最后，我们对所有的标签重复此操作，然后将得分最高的标签作为此细胞的注释。
同时，该程序包还提供了一个网页版的工具，可以在线对单细胞转录组数据进行细胞类型注释分析，可以通过以下网址进行访问: https://comphealth.ucsf.edu/app/singler
最新版SingleR一大优点就是提供了较多的数据集，不是之前的所有数据集整合在里面，我们看不见摸不着，而且细胞类型较少，新的数据集有7种，主要是人和小鼠物种，特别的两个物种的免疫基因，可以把细胞分成很细的T细胞。
==安装====
devtools::install_github('dviraran/SingleR')
==测试例子===
这里先使用来自scRNAseq包中的两个人类胰腺数据集。目的是使用一个预先标记好的数据集对另一个未标记的数据集进行细胞类型注释。首先，我们使用Muraro et al.(2016)的数据作为我们的参考数据集。
library(SingleR)
library(scRNAseq)
//加载参考数据集
sceM <- MuraroPancreasData()
sceM <- sceM[,!is.na(sceM$label)]
//对表达数据进行log归一化处理
sceM <- logNormCounts(sceM)
//加载测试数据集
sceG <- GrunPancreasData()
sceG <- sceG[,colSums(counts(sceG)) > 0] # Remove libraries with no counts.
sceG <- logNormCounts(sceG)
sceG <- sceG[,1:100] //为了加快速度，只取了前100个
//然后使用SingleR()函数进行细胞类型注释分析，但要使用标记检测模式（marker detection mode），该模式会考虑跨细胞表达的差异。在这里，使用Wilcoxon ranked sum test检验来识别标签对之间比较的topmarkers。与默认的标记检测算法相比，此方法会更慢，但更适用于单细胞测序数据（对于中位数通常为零的低覆盖率数据，它可能会失败）。
pred.grun <- SingleR(test=sceG, ref=sceM, labels=sceM$label, de.method="wilcox")
//可以查看细胞类型注释的预测结果
SingleR包提供了一些常用的可视化工具。我们可以使用plotScoreHeatmap()函数显示所有参考标签中所有细胞的分数，这可以让我们检查整个数据集中预测标签的置信度。每个细胞的实际分配标签显示在顶部的颜色栏中。注意，如果进行了微调，这可能不是视觉上得分最高的标签，因为只有预先调整的分数才能在所有标签上直接比较。
上面的图中，我们主要是检查每个细胞内得分的分布。理想情况下，每个细胞（即热图的列）应具有一个明显比其他细胞高的分数，这表明它已被明确地分配给单个标签。
默认情况下，SingleR()函数会以pruned.labels字段来报告出修剪的标签，其中低质量的分配以NA表示。但是，默认的修剪阈值可能不适用于每个数据集。我们提供了plotScoreDistribution()函数来通过使用具有相同标签的细胞中的信息来帮助确定阈值是否合适。这将显示每个标记的跨细胞分布，其中pruneScores()函数以低于3个中位数绝对偏差（MAD）值来定义适当的阈值。
==导入seurat格式===
//以前面处理的pbmc的数据为例子，前面处理和seurat类似
counts <- pbmc@assays$RNA@counts
clusters <- pbmc@meta.data$seurat_clusters
ann <- pbmc@meta.data$orig.ident
meta=pbmc@meta.data #pbmc的meta文件，包含了seurat的聚类结果
pbmc_for_SingleR <- GetAssayData(pbmc, slot="data") ##获取标准化矩阵
pbmc.hesc <- SingleR(test = pbmc_for_SingleR, ref = hpca.se, labels = hpca.se$label.main) # 使用HumanPrimaryCellAtlasData参考数据集，main大类注释
print(plotScoreHeatmap(pbmc.hesc))
pbmc@meta.data$labels <-pbmc.hesc$labels
print(DimPlot(pbmc, group.by = c("seurat_clusters", "labels"),reduction = "umap"))
注：umap直观的可以看到通过singleR注释的细胞标签准确性应该可以（不过注意这儿时pbmc数据集，有些组织单细胞数据可能就不是这样了哦，可能会很乱，做好心理准备哦）
==别的参考数据集===
另一种是不用这儿的参考数据集，利用已有参考数据集，给其它数据集注释（Seurat也能实现）
这儿从pbmc数据集中抽取500个细胞作为新的数据集pbmc1,使用前面给pbmc打上的标签，为pbmc1重新打标签
pbmc1 <-pbmc[,1:500]
test <- GetAssayData(pbmc1, slot="data")
library(scran)
pbmc1.hesc <- SingleR(test=test, ref=pbmc_for_SingleR, labels=pbmc$labels, de.method="wilcox")
pbmc1@meta.data$labels1 <-pbmc1.hesc$labels
print(DimPlot(pbmc1, group.by = c("seurat_clusters", "labels"),reduction = "umap"))
因为pbmc1是从pbmc抽取的，所以新的标签和之前的一致。
当然还可以使用多个数据集作为参考集。
//ref这里用多个数据集
pbmc.hesc <- SingleR(test = pbmc_for_SingleR, ref = list(BP=Blue.se, HPCA=hpca.se), labels = list(Blue.se$label.main, hpca.se$label.main))
table(pbmc.hesc$labels,meta$seurat_clusters)
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