##Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation
摘要：
背景：全基因组转录组分析极大地促进了对基础心脏生物学和疾病驱动机制的调控网络的理解。然而，到目前为止，研究成人心脏基因表达模式的分辨率仅限于整个组织提取物的水平。组织匀浆的使用固有地导致基因表达中细胞起源或细胞类型特异性变化的任何信息的丢失。RNA扩增策略的最新发展为使用少量输入RNA进行单细胞全基因组测序提供了独特的机会。
方法：提出一种从成年小鼠消化的心脏组织中获得高质量RNA的方法，用于健康和患病心脏的自动单细胞测序。
结果：优化后，能够在稳态条件下和缺血损伤后对成年心脏组织进行单细胞测序。基于差异基因表达的聚类分析揭示了所有主要心脏细胞类型的已知和新标记。基于基因表达的差异，可以在某一细胞类型中识别多个亚群。此外，对健康和受伤的心脏应用单细胞测序表明存在疾病特异性细胞亚群。因此，鉴定了细胞骨架相关蛋白4（CKAP4）作为活化成纤维细胞的新标记物，其与小鼠和人类心脏组织中已知的肌成纤维细胞标记物呈正相关。与对照组相比，用转化生长因子β处理的活化成纤维细胞中的细胞骨架相关蛋白4的抑制引发了与活化成纤维相关基因表达的更大增加，这表明细胞骨架相关蛋白质4在调节受损心脏中成纤维细胞活化中的作用。
结论：对健康和患病成人心脏进行单细胞测序，可以研究心脏细胞之间的转录组差异，以及心脏病期间基因表达的细胞类型特异性变化。这一新方法为与心脏生物学和病理生理学相关的细胞过程中的分子变化提供了丰富的新见解。应用这项技术可能会发现与心脏病相关的新治疗靶点。
实验动物：C57BL/6J小鼠，缺血再灌注（IR）手术。术后3天收集并分析心脏。
取样区域：梗死区（梗死区和边缘区）或对照心脏的相应区域
结果：
1.Isolation of High-Quality RNA From Digested Hearts From Adult Mice
为了创建所有心脏细胞类型的可靠基因表达图谱，首先确定组织消化和RNA提取的最佳方法，以从心脏的单细胞悬浮液中获得高质量RNA。处死小鼠，然后用冷灌注缓冲液灌注心脏。收集左心室前壁后，将组织在冰冷的灌注缓冲液中清洗，保存在冰上，切碎成小块，并转移到装有冷消化缓冲液的玻璃瓶中。消化组织后，将细胞悬浮液轻轻地上下吸移，然后将裂解物通过100μm的细胞过滤器。然后用DMEM冲洗过滤器，收集细胞用于随后的RNA提取或流式细胞术（图1A和1B）。基于细胞形态和RNA质量，在Trizol RNA分离之前，使用游离酶在37°C摇动水浴中消化成年心脏组织15分钟，是获得心脏单细胞悬浮液的最佳方法。
2.Single-Cell Sorting Strategy
酶法分散心脏组织后，用流动比色法分离细胞。使用大喷嘴尺寸（130µm）可以分选所有范围的心脏细胞，而不会损伤更大的心肌细胞。后续实验证明心肌细胞大多完好。
3.Single-Cell Sequencing to Identify Gene Expression Signatures in All Main Cardiac Cell Types
使用SORT-Seq协议，平均每个细胞检测到5个原始唯一读取。在质控后，来自3个不同对照心脏的426个细胞用于下游的分析。使用RaceID2算法识别和分析所有主要的心脏细胞类型，1-Pearson相关系数的K-medoids聚类显示成年心脏中有14个不同的细胞簇（图2A）。t-SNE图表明存在心肌细胞（图2D）、成纤维细胞（图2E）、内皮细胞（图2AF）和巨噬细胞（图2G）。
3.Contribution of Mitochondrial Transcripts Differ for Individual Cell Types
在研究所有主要心脏细胞类型中的基因表达特征时，观察到线粒体和基因组转录物的贡献在不同细胞中不同。与其他心肌细胞类型相比，所有心肌细胞的线粒体转录物百分比更高（占总转录物的58%至86%）。由于线粒体转录物非常丰富，将其排除在聚类分析之外，只关注基因组基因的差异表达。
4.Single-Cell Sequencing Identifies Cell Type-Specific Subpopulations in the Healthy Heart
根据标记基因的基因表达，识别了4个不同的心肌细胞簇、2个内皮细胞簇、2个成纤维细胞簇、2个巨噬细胞簇、1个平滑肌细胞簇和1个红细胞簇。在心肌细胞4中，该簇表达心肌细胞标记物，如心肌肌钙蛋白t、Tnnt2（图4A）。然而，它是唯一富含Myozen2（Myoz2）表达的心肌细胞亚群（图3和4B）。在小鼠中也同样检测到了富含Myoz2的心肌细胞簇，且富含Myoz2的心肌细胞簇确实不同于其他心肌细胞簇。
免疫组织化学显示，MYOZ2在位于心脏心外膜表面的一层心肌细胞（与TNNT2共染色）中富集（图4C）。与其他心肌细胞相比，富含Myoz2的簇中最受差异调节的基因的基因本体分析表明，高检测基因与中枢神经系统的退行性疾病有关（图4D），而低表达基因似乎与心脏疾病相关（图4E）。Myoz2，也称为Calsarcin-1，是病理性促肥大磷酸酶钙调素的抑制剂。
5.Single-Cell Sequencing of the Injured Heart
将小鼠暴露于缺血损伤（IR）中，并在IR后3天收集样品。从心脏梗死区域分离了509个单独的细胞。将这些细胞与先前从对照心脏相应区域获得的426个细胞合并，用于RaceID2的计算机分析。1-Pearson相关性的K-medoids聚类显示对照组和IR心脏后3天的所有汇集细胞中有17个不同的细胞簇。
6.Inter- and Intracellular Gene Expression Changes Induced by Ischemic Injury
损伤引发了疾病富集细胞簇的出现，识别到3个不同的成纤维细胞簇（7、13和15）（图5B至5D）。簇13和簇15中的细胞主要来源于受伤的心脏，而簇7包含来自两种情况的细胞（图5C和5D）。来自簇13和簇15的细胞的特征是Postn、Wisp1和Tnc的相对高表达，先前与成纤维细胞活化相关，t-SNE图谱再次证实了这些基因在疾病富集的成纤维细胞簇中的富集表达。通过对对照或受伤心脏的心脏组织进行qPCR验证了这些基因的疾病特异性诱导（图5F）
7.Ckap4 Expression Is Specifically Increased in Activated Fibroblasts
在确定了来自健康和患病心脏的成纤维细胞群体（簇7）和主要来自患病心脏的群体（簇13和簇15）后，接下来确定了这些群体之间的差异表达基因。疾病富集的成纤维细胞群体中有11个基因上调，20个基因下调（图5G）。发现205个基因在健康和来自簇1、3、4和8的缺血心肌细胞，而来自健康或缺血心脏的巨噬细胞中差异表达191个基因，形成簇5、9、14和16。这些疾病富集簇中的上调基因与细胞外基质沉积和胶原沉积相关的各种过程有关（图5H），这是心脏缺血损伤后纤维化反应的标志。根据这一观察，在富集的基因中，检测到已知在活化的成纤维细胞中表达的各种胶原基因和标记物，如Postn（图5I）。对缺血性心脏中富含疾病相关基因的聚类的鉴定进一步强调了我们聚类方法的有效性。
除了已知的活化成纤维细胞标记物外，还发现Ckap4在这群活化成纤维纤维细胞中上调。Ckap4是一种跨膜蛋白，可以作为不同细胞中各种配体的受体。然而，其在心脏成纤维细胞中的功能仍然未知。通过bulk-RNA测序来确认缺血损伤后整个心脏中Ckap4的上调（图5J）。单细胞测序数据检测到Ckap4在活化的成纤维细胞中的特异性上调，而不是在任何其他细胞类型中的上调(t-SNE)（图5K和5L）。通过免疫组织化学，验证缺血损伤后心脏中CKAP4的诱导，其与表达成纤维细胞标记物波形蛋白的细胞重叠（图6A）。为了研究活化成纤维细胞中Ckap4表达的功能相关性，抑制了成纤维细胞的Ckap2表达，然后将其暴露于TGFβ中（图6B）。与对照组相比，TGFβ能够诱导Ckap4表达。siRNA介导的Ckap4抑制导致了mRNA和蛋白质水平上的Ckap4的剂量依赖性降低（图6C）（图6D）。qPCR分析表明，TGFβ治疗导致活化成纤维细胞标记物表达的增加，并且在这种条件下抑制Ckap4进一步增强了这种作用（图6E）。尽管这一发现值得进一步研究，但这似乎意味着活化成纤维细胞中的CKAP4能够抑制与活化成纤维相关基因的表达。同样，在来自缺血性心脏病患者的心脏样品中，我们能够确认CKAP4和已知在激活的心脏成纤维细胞中诱导的基因之间的表达正相关（图7A至7C）。此外，免疫组织化学显示，人类缺血心脏中CKAP4表达与各种成熟的成纤维细胞标记物之间存在强烈重叠（图8D），这表明CKAP4在人类活化的成纤维纤维细胞中也有作用。
DISCUSSION
一部分心肌细胞表达Myoz2，一种属于肌聚蛋白家族的蛋白。Myoz2已被证明能将α-肌动蛋白与钙调神经磷酸酶（一种众所周知的心肌细胞肥大诱导物）连接，从而抑制心肌细胞的病理性肥大反应。Myoz2的表达仅限于心肌细胞的一个子集，提示主要位于心脏的心外膜区域的心肌细胞亚群对钙调神经磷酸酶介导的肥大反应不同，其中一些细胞比其他细胞更具抵抗力。
对健康和受伤心脏的单细胞测序数据集进行比较表明，疾病会产生已知细胞类型的新亚群，这些亚群似乎对来自患病心脏的细胞具有特异性或富集性。尽管已知心脏的细胞组成在病理应激期间发生变化，但在检测心脏应激期间每种细胞类型内特异性表达的全基因组变化方面的能力有限。单细胞测序数据现在允许识别不同条件下所有主要心脏细胞类型的转录组差异。通过定义与疾病相关的细胞亚群和基因表达的相关变化，确定与心脏病潜在细胞变化相关的新分子机制。本研究发现Ckap4在与Postn、Ctrc1和Fn1相同的细胞群中表达，Postn是心脏肌成纤维细胞的已知标志物。对照组和对照组的免疫组织化学缺血性心脏证实CKAP4的表达对应激心脏是特异性的，并且与波形蛋白重叠，波形蛋白是缺血性心脏中成纤维细胞的标志物。体外Ckap4功能的丧失表明，在TGFβ刺激前后，肌成纤维细胞相关基因过度激活，这表明Ckap1在成纤维细胞激活过程中起作用。此外，在缺血性心脏病患者的心脏活检中观察到CKAP4和成纤维细胞标记物之间的正相关。
