一、酵母双杂交技术原理
膜体系酵母双杂交原理为分裂泛素机制，泛素是一种小型蛋白质，能够标记目标蛋白以便其被降解，通过将泛素分为N-端（Nub）和C-端（Cub）两部分。两个膜相关蛋白间发生互作引起泛素重组、裂解蛋白进而释放转录因子（LexA）启动报告基因的表达，最终鉴定蛋白发生互作(Stagljar et al., 1998)。膜体系酵母cDNA 文库的构建，弥补了传统核体系酵母双杂交系统不能筛选、鉴定膜相关蛋白互作的不足(Mo et al., 2004)。（前期可通过亚细胞定位实验来判断目标基因的定位情况，进而选择核系统或者膜系统）
图：酵母双杂（膜）原理
二、诱饵载体类型的选择
注：若N端和C端都位于胞外，可截短使得C端出现位于胞内段，再选择相应载体。
当二者在物理空间上靠近时可以表现出完整的转录因子活性，基于此，把目的蛋白分别与BD、AD融合表达，当目的蛋白发生互作时，使得BD、AD在物理空间可以靠近，这时就能够表现出完整的转录因子功能，从而激活下游基因的表达。
三、实验步骤
1.酵母转化方法
（1） 从 YPDA 平板挑取酵母菌单菌落接种于 YPDA 液体培养基，30℃，225 rpm， 振荡培养（过夜），调节 OD值。
（2） 转接 YPDA 液体培养基， 30℃，225 rpm，振荡培养。
（3） 室温条件下离心收菌。
（4） 用无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，弃上清。
（5） 用 LiAc 重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，弃上清。
（6） 用 LiAc 重悬菌体，混匀，分装至离心管， 备用。
（7） 每个离心管中依次加入如下试剂（50%PEG3350、1MLiAc、ssDNA,10mg/ml、质粒DNA），用枪头吹打混匀，或剧烈振荡，至完全混匀。
（8） 30℃水浴孵育。
（9） 42℃水浴热激。
（10） 30℃水浴复苏。
（11） 离心收菌，室温，弃上清。
（12）每个转化用无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板。
（13）30℃恒温培养 4 天左右。
2.自激活检测
将实验组与对照组点板于不同浓度的SD-TLH（含3-AT与X-Gal的缺陷型平板上）。
图：自激活检测结果
阳性对照在不同3-AT浓度的缺陷培养基上均能生长，并且随着3-AT浓度增加，菌落数量减少。由自激活检测结果看出，在添加0 mM 3-AT的平板上没有生长，显示未激活HIS3报告基因。
结论：该目的基因A没有自激活能力（若有则通过添加一定浓度的3-AT来抑制自激活方可进行后续互作验证实验）。
3.互作验证
将实验组与对照组点板于SD-TL、SD-TLH、SD-TLH+X-Gal、SD-TLHA、SD-TLHA+X-Gal培养基上。
图：互作验证
阳性对照组与实验组pBT3-SUC-A+pPR3-N-B在SD-TL、SD-TLH、SD-TLH+X-Gal、SD-TLHA、SD-TLHA+X-Gal平板均能正常生长，并能在SD-TLH+X-Gal、SD-TLHA+X-Gal缺陷型平板上显蓝色，而其它阴性对照组在三四缺培养基上既不生长也不显蓝色。
结论：pBT3-SUC-A与pPR3-N-B互作。
四、疑问解答
1.如何判断Bait的N、C端位置呢（氨基端是N端、羧基端是C端）？
a. 跨膜结构域预测网站：
TMHMHH：DeepTMHMM 1.0 - DTU Health Tech - Bioinformatic Services
b. 膜蛋白拓扑结构和信号肽的共识预测：
TOPCONS: Consensus prediction of membrane protein topology and signal peptides
c. 信号肽预测网站：
SignalP 6.0 - DTU Health Tech - Bioinformatic Services
图：载体选择方式
2.什么是3-AT试剂，该如何使用？
3-AT是酵母HIS3蛋白合成的竞争性抑制剂，用于抑制HIS3基因的泄漏表达。可设置不同的浓度梯度0、2.5、5、10、20、30、40、50、75、100 mM。
3.X-α-Gal与X-Gal的区别是什么？
X-α-Gal检测酵母MEL1基因的激活。MEL1是Gal4酵母双杂交系统的一个报告基因，编码分泌α-半乳糖苷酶。该酶可水解无色的X-α-Gal底物并最终产生蓝色底物。表达α-半乳糖苷酶的酵母菌落在含有X-α-Gal的培养基上显蓝色，即阳性的双杂交作用。X-α-Gal可在培养基上直接检测酵母双杂交相互作用，利用此底物可以省去双杂交体系中的β-半乳糖苷酶溶液和filter-liftassays；
X-Gal用于检测LacZ基因合成的 β-半乳糖苷酶的活性。由于β-半乳糖苷酶不能分泌，需裂解酵母细胞后通过加入β-半乳糖苷酶溶液和filter-liftassays才能进行显色，因此操作流程相对繁琐。
其中携带MEL1基因的酵母菌株包括：Y2HGold、Y190、AH109、Y187、PG69-2A。
4.想筛的蛋白是定位在核里面的，用膜文库能筛到吗？
可以，构建膜文库是提的总RNA里面核或者膜蛋白都有，只是咱们诱饵是膜蛋白，用膜体系来筛更好，不过有些实验室核和膜都会筛一遍。
5.有核文库，能用膜蛋白来筛吗？
一般膜蛋白都是用泛素化膜体系来筛的，也有人核和膜都筛过，但最终膜体系筛出来的更符合预期。
6.酵母双杂膜体系和核体系有什么不同？
膜体系是DUAL membrane system，只能做酵母双杂，主要针对膜蛋白来筛库，文库是构建到PPR3-N，诱饵基因在PBT3系列载体（一般双杂体系中，PBT3-N与PPR3-N载体用得比较多）。
7.实验中的假阳性与假阴性问题该如何解决
假阳性情况：
先做诱饵自激活检测：转染诱饵质粒后，在缺陷培养基（如 SD/-Trp-His、SD/-Leu-Trp-His、）上观察是否生长，排除自激活情况。
假阴性情况：
1. 验证蛋白定位：通过荧光标签（如 GFP实验）观察诱饵/猎物是否定位于细胞膜；2. 优化载体：选择酵母偏好密码子的载体，或添加膜定位信号肽；3. 降低筛选严谨性：先使用低严谨平板（如 SD/-Trp-Leu-His）初筛，再逐步提高条件。
8.实验失败的原因（膜定位方面）？
膜系统依赖蛋白正确定位于细胞膜，若该步骤失败常常导致实验失败。
原因：
（1）膜蛋白跨膜结构域过多，酵母无法正确折叠；
（2）载体缺少膜定位信号。
解决方法：
（1）截短膜蛋白（仅保留关键互作结构域以及1-2个跨膜区）；
（2）使用自带膜定位序列的专用载体（如 pBT3-STE、pPR3-N）。
9.互作验证实验理论上应如何设置组别？
阳性对照、空白对照（PBT3-N+ PPR3-N）、阴性对照（PBT3-N-A+ PPR3-N、PBT3-N+ PPR3-N-B、）、实验组（PBT3-N-A+ PPR3-N-B）。
培养基类型：SD-TL、SD-TL+X-Gal（可选）、SD-TLH、SD-TLH+X-Gal、SD-TLHA、SD-TLHA+X-Gal。
五、参考文献
[1] Stagljar I., Korostensky C., Johnsson N., and te Heesen S., 1998, A genetic system based on split-ubiquitin for the analysis of interactions between membrane proteins in vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 5187-5192.
[2] Mo C., Valachovic M., and Bard M., 2004, The ERG28-encoded protein, Erg28p, interacts with both the sterol C 4 demethylation enzyme complex as well as the late biosynthetic protein, the C-24 sterol methyltransferase (Erg6p), Bioachimica et Biophysica Acta, 1686: 30-36.
