酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）技术是一种经典且广泛应用于蛋白质-蛋白质相互作用研究的分子生物学方法。自20世纪90年代初首次提出以来，酵母双杂交技术已经成为探索分子互动的强大工具，特别在细胞信号传导、基因调控、疾病机制等领域的研究中，扮演着不可或缺的角色。
1. 酵母双杂交实验原理
酵母双杂交实验基于酵母细胞内的转录激活机制，利用两种融合蛋白质（DNA结合域和转录激活域）在酵母细胞中的相互作用来检测蛋白质之间的相互作用。具体来说，酵母双杂交实验将目标蛋白质与特定的DNA结合域（DNA-BD）或转录激活域（AD）融合。当两个融合蛋白质相互作用时，DNA-BD和AD部分会重新结合，启动下游报告基因的表达（如HIS3、LacZ等），从而间接地显示出目标蛋白质间的相互作用。
酵母双杂交实验的基本步骤包括：
1).目标蛋白的克隆：将目标蛋白的基因分别克隆到DNA-BD和AD表达载体上。
2).酵母转化：通过酵母细胞转化技术将DNA-BD和AD载体导入酵母细胞中。
3).筛选和验证：通过选用特定培养基（如SD/-His）进行筛选，获得阳性克隆，并进一步验证蛋白质相互作用的可靠性。
2. 酵母双杂交文库构建
酵母双杂交文库构建是酵母双杂交实验的关键步骤之一，成功的文库构建直接关系到后续筛选结果的质量。文库构建的核心是将不同的基因片段或cDNA克隆到表达载体中，形成包含广泛蛋白质或基因的文库，为后续的相互作用筛选提供可能的候选蛋白。
2.1 文库构建的步骤
1).文库来源选择：
- cDNA文库：最常见的来源是从特定细胞或组织中提取的mRNA反转录得到的cDNA。cDNA文库能够代表目标细胞或组织中所有转录的基因。
- 基因片段文库：对于特定蛋白质的研究，也可以直接使用基因片段（例如全基因组的DNA片段）进行文库构建。
2).克隆目标基因：将目标基因或cDNA克隆到合适的酵母表达载体中，通常这些载体会含有能够将目标蛋白与转录激活域（AD）融合的功能区域。常用的酵母表达载体有pGADT7、pGBKT7等。
3).文库转化：通过转化方法（如PEG-锂盐法），将含有cDNA或基因片段的表达载体转化到酵母细胞中，建立文库。确保转化的酵母数量足够，以便覆盖所有可能的相互作用。
4).文库的质控：构建文库后，需要通过PCR和测序等方法确认文库的多样性和准确性，确保每个载体中只含有一个目标基因片段。
2.2 构建文库的关键要点
- 文库的多样性：一个高质量的文库需要涵盖足够的基因或蛋白质库，这样才能确保筛选到更多潜在的相互作用。
- 文库的质量：应注意文库的文库文库大小、文库构建过程中的转化效率，以及文库转化后的存活率，确保构建文库的稳定性。
3. 酵母双杂交文库筛选
酵母双杂交文库筛选是酵母双杂交实验的核心步骤之一，筛选的目的是从构建的文库中快速发现与目标蛋白相互作用的蛋白质。通过筛选不同的酵母菌株并检测其是否能激活报告基因的表达，筛选出那些可能具有相互作用的蛋白质。
3.1 筛选流程
1).文库转化：首先，将酵母双杂交文库转化到含有DNA结合域（DNA-BD）融合的目标蛋白质的酵母菌株中。
2).筛选条件设定：
- 选择培养基：根据所用的报告基因（如HIS3、LacZ等），选择合适的培养基，通常使用含有缺失氨基酸或抗生素的选择培养基。常见的培养基为SD/-His或SD/-Leu/-Trp/-His。
- 筛选条件：筛选条件的选择依据报告基因的表达情况，如HIS3报告基因可利用选择培养基的组氨酸缺失来筛选成功转化的酵母。
3).筛选结果分析：通过培养和筛选，获得能够在选择性培养基上生长的阳性克隆。每个阳性克隆都表示有一个可能的蛋白质相互作用。进一步验证这些克隆的蛋白质相互作用的可靠性。
4).二次验证：通过克隆和单独表达筛选到的蛋白质对酵母进行验证，结合其他方法（如Co-IP、GST pull-down等）进一步验证其生物学意义。
3.2 筛选结果的分析
- 阳性克隆的筛选：通常，筛选的阳性克隆需要进一步确认其相互作用的特异性和可信度。通过对这些阳性克隆的DNA进行测序，可以鉴定出与目标蛋白质相互作用的候选蛋白质。
- 筛选的质量控制：需要注意，筛选过程中的伪阳性或伪阴性结果需要通过重复实验或使用其他实验方法进行验证。
4. 酵母双杂交实验中的注意事项
酵母双杂交实验虽然是一个强大的工具，但在实验过程中也存在一些挑战和注意事项：
- 实验条件的优化：实验中的各种条件，如酵母菌株的选择、表达载体的使用、筛选条件等，都可能影响实验的灵敏度和特异性。因此需要进行充分的优化。
- 文库的质量控制：为了保证酵母双杂交文库的多样性和有效性，需要在构建文库过程中严格把控每个环节。
- 数据的验证：筛选出的阳性克隆需要多种技术进行验证，以确保筛选结果的准确性和可重复性。
在蛋白质互作研究中，酵母双杂交技术是不可或缺的工具。泰克生物提供的酵母双杂交服务能够通过构建高效的文库筛选出潜在的相互作用蛋白质。双杂交技术通常包括诱饵蛋白和猎物蛋白两种构建体，酵母细胞通过双重融合表达与报告基因的激活筛选出目标互作蛋白。泰克生物凭借其专业的服务，帮助客户优化实验流程，提高筛选效率，进而加速科研进展。
