作者，Evil Genius
5月的最后一天了，马上过六一儿童节了，心思已经不在工作上了。
所以今天我们分享一个冷门东西，细胞分割，也就是Xenium、seqFISH等原位测序采用的划分细胞的技术，其实到了这里，大家就应该明白，任何技术的背后，都是数学、AI和机器学习，就是人才的较量。尤其在肿瘤早筛的运用中，算法和训练模型至关重要，这也是我最近参与的公司项目。
其实在visium测序的时候有人就提过这样的想法，例如单细胞空间联合分析的方法SpatialScope，就利用深度生成模型整合空间和单细胞转录组数据。文章在Integrating spatial and single-cell transcriptomics data using deep generative models with SpatialScope | Nature Communications
我之前也分享过，文章在单细胞空间联合分析之SpatialScope
大家注意看此时的空间转录组不再是规整的排布了，而是进行了一定程度的细胞分割。
在单细胞空间联合分析的方法Tangram中，也有类似的操作，分享的文章在10X单细胞空间联合分析之六(依据每个spot的细胞数量进行单细胞空间联合分析)----Tangram
当然前面这些都是基因图片，识别每个spot有多少个核，从而划分的精细一点，还没有达到我们想说的单细胞级别的划分。
关于图像分割，我们首先来看Xenium的技术，也是最近需要分析的项目，其说明网址在10X的官网，https://www.10xgenomics.com/cn/support/software/xenium-onboard-analysis/latest/algorithms-overview/segmentation，注意从这里开始就是针对原位的数据了。
- 在 Xenium 原位基因表达测定中，DAPI 图像用于使用机器学习算法推断细胞核边界;然后通过各向同性核膨胀推断细胞边界。
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在 Xenium 原位基因表达与细胞分割染色测定中，使用多组织染色和多模式细胞分割方法确定细胞边界。
第一步也是一样的，Nucleus segmentation
- 第一步是使用DAPI图像和自定义神经网络进行核分割来检测核的位置。神经网络在数千个人工标记的图像补丁上进行训练，这些图像补丁覆盖了多种组织类型。任何细胞核95%或更多的像素强度低于100个光电子的强度阈值将被移除。
识别核的位置后，接下来就是细胞分割
- 多模态细胞分割算法使用自定义深度学习模型对多通道染色图像进行分析。这些模型在10x Genomics Xenium In Situ数据上进行训练，其中包括一系列组织类型和制剂(新鲜冷冻，FFPE)。
After nucleus segmentation with DAPI, the algorithm uses three methods to segment cells.
对于每个细胞，分割结果的优先级是这样的:
- 根据细胞边界染色对细胞进行分割:从这种方法推断出的分割应该最接近真实的细胞膜边界。它使用细胞表面标记抗体靶向上皮标记物(ATP1A1, E-Cadherin)和免疫标记物(泛淋巴细胞:CD45)。该方法可以分裂细胞核，定义缺核细胞，鉴定多核细胞。与无核细胞重叠的细胞核被分配给细胞。
- 基于从细胞核扩展到细胞内部染色边缘的细胞分割方法:该方法包括深度学习模型和使用内部染色推断细胞边界的核扩展方法。采用内部染色(18S rRNA标记)和DAPI染色检测细胞核。XOA v2.0细胞分割算法目前不使用内部蛋白染色(alphaSMA/Vimentin)，因为18S标记已经足够用于大多数组织类型。推断的细胞轮廓可能看起来不规则的情况下，细胞内部染色之间的边界是具有挑战性的识别(即，对于致密组织类型)。
- 细胞核扩展:对于没有边界或内部染色的细胞，以细胞核(DAPI)扩增距离为5µm或直到遇到另一个细胞边界
其中细胞核扩展
一旦样品中细胞核的位置被模型识别，一个启发式的细胞边界扩展步骤被执行。细胞核边界扩大5µm或直到它们在X-Y方向遇到另一个细胞边界。如果在扩展过程中细胞边界重叠，则使用概念上类似于Voronoi镶嵌的算法来解决。
不得不说10X公司对于产品的软件配套能力是真的强，这方面国内就逊色很多。但是这种分割方法也存在问题，那就是对于拿着不规则的细胞，比如神经细胞、肌肉细胞等划分的还是不精确，这一点的得到了上海10X技术人员的确认。
另外一个比较好的细胞分割技术是SCS，文章在SCS: cell segmentation for high-resolution spatial transcriptomics（nature methods）。该方法利用深度学习和图像处理技术，从高分辨率空间转录组图像中分割出单个细胞，并为每个细胞分配一个唯一的标识符。SCS不仅可以提高细胞分割的准确性和效率，而且可以为后续的空间转录组数据挖掘和生物学发现提供有价值的信息。
SCS主要分为以下三步：
- ① 首先通过分割染色图像来识别细胞核（图2a红色）内的spot。
- ②接下来在这些点和一些背景点上训练transformer，以预测从每个点到其所属细胞中心的梯度方向，以及它是细胞一部分或细胞外基质的一部分的概率。Transformer针对每个输入点预测16个预定义方向从该点到其细胞中心的概率以及该点是细胞一部分的概率。对于每个点，Transformer通过基于点表达式 (x) 和相对位置 (s) 自适应学习权重，聚合来自其 50 个最近相邻点的信息。
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③ 然后将transformer应用于所有其他点。用梯度流跟踪算法根据梯度预测对点进行分组来分割细胞。
这个技术运用在了Stereo-seq上面有很好的效果。
当然了，还有很多其他的细胞分割方法等待我们去探索
