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题目：Ageing hallmarks exhibit organ-specific temporal signatures
通过对小鼠中17个器官和组织在10个不同时间节点进行RNA测序，建立了小鼠衰老细胞图谱，为衰老过程的研究提供了高时空分辨率的基因表达图谱数据库。
在本工作中，为了揭开整个生物体衰老中的动态变化过程，作者们对从C57BL/6JN品系的四只雄性小鼠和两只雌性小鼠中10个不同时间节点的17个器官和组织中细胞质蛋白进行了测量同时对以及RNA进行了测序（图1）。十个不同时间节点1、3、6、9、12、15、18、21、24、27个月分别相当于人类年龄的13、20、30、36、43、50、56、63、69、75岁。作者们从每只小鼠中分离的17中器官和组织主要包括骨头、脑部、棕色脂肪组织、性腺脂肪组织、心脏、肾脏、肌肉、肝脏、肾脏、骨髓、肠系膜脂肪组织、胰腺、皮肤以及小肠、脾脏等等。
同时，作者们还对小鼠的20个器官的529,823个细胞进行了单细胞RNA测序，生成了一个Tabula Muris Senis图谱，同期发表在Nature杂志上题为A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse（图2）。
衰老导致器官和组织正常功能减退，扰乱其中复杂的组织和细胞间的交流，而这种相互交流对于维持机体的健康至关重要。但是目前对于器官之间的衰老缺乏基本的比较和了解。因此，作者们进行了两两差异表达，以确定差异表达基因(Differentially expressed genes, DEGs)何时出现以及它们是否随年龄增长而持续存在。通过对大量RNA-seq数据进行分析后，作者们发现虽然在相邻近的年龄的小鼠器官之间存在少量的基因表达差异，但是大多数器官相对于3个月大的成年小鼠基因差异表达的基因数量明显增加，这说明在足够的时间后才能检测到基因表达在衰老过程中持续性、渐进性的变化。
进一步地，作者们想知道幼年时期出现的差异表达基因是会随着年龄的增长而持续还是会被新的DEGs所取代。作者们分析发现，大多数的器官中早期和晚期的DEGs是存在明显的相关性的。但是也有少数基因在任意一个单独的年龄中的变化都非常独特，其器官的特异性大于年龄特异性。当分离出器官间表达差异最频繁的基因时，作者们发现与免疫应答途径相关的基因存在明显的富集。另外，生物钟相关的基因在衰老过程中也有独特的变化，与年龄相关的昼夜节律紊乱是众所周知的【2】，这些数据突出了昼夜节律在健康状况中的重要作用。
由于作者们的数据可以提供一个高时空分辨率的衰老过程信息，作者们想通过整合这些数据揭示整个生物体在衰老过程中的变化。作者们首先建立不同器官在整个生命周期中的基因表达轨迹，并将这些平均轨迹聚集在一起，对衰老过程中如炎症增加、线粒体功能障碍和蛋白稳定丧失等特征变化进行富集。作者们发现这些特征具有显著的动态变化模式（图3）。比如说Cluster3中线粒体相关基因在衰老过程中的表达线性下降，而Cluster7中与蛋白质折叠相关的热激蛋白只在12个月年龄以后才会出现显著下降（图3）
关于衰老过程中机体转录组变化的一个基础性问题是观测到的基因表达变化是由细胞内在的变化导致的还是由于随着年龄增长细胞的组成发生了变化。作者们根据单细胞RNA-seq测序数据对每个组织中每个基因建立了一个分布的离散指数统计。
另外，作者们还通过对Tabula Muris Senis图谱中细胞分选耦联Smart-seq2以及微流控液滴基础的scRNA-seq这两个数据库进行分析，最终确认细胞种类的不同以及细胞内在基因表达的变化均会在大多数组织中的衰老过程中出现，但是总的来说，细胞种类组成看起来是更重要的决定因素。除此之外，作者们还尝试建立了每个器官中衰老相关的蛋白质组变化与相应的基因表达轨迹的关联，来确定哪些器官细胞质中蛋白质组的变化导致了与衰老相关的变化。
该工作所建立的数据库提供了整个小鼠生命周期中主要器官和组织的转录组与蛋白质组信息，发现了小鼠衰老过程中的基因表达变化特征，为多学科交叉研究提供了重要的基础和资源。
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全文看：
在全世界，造成疾病和死亡的最主要的原因是变老，了解衰老过程之间的关系能极大地提高生活的质量，尽管最主要的衰老的种类损害已经被确定，例如intercellular communication--细胞通讯， loss of proteostasis--失去蛋白质平衡，eroded mitochondrial function--侵蚀线粒体功能---------- 这些有害的过程与器官内部和器官之间异常复杂的相互作用，
对老化动力学的全有机体分析一直缺乏， 在这里，我们对17个器官进行了大量RNA测序，并在小鼠的寿命中进行了10个年龄的血浆蛋白质组学，Tabula Muris Senis-小鼠衰老细胞图谱，
Tabula Muris：The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a
Tabula Muris.
本文中揭示了衰老过程中基因表达的线性和非线性的变化，
extracellular matrix regulation,--细胞外机制调节
mitochondrial function, 线粒体功能，
infammatory and immune response.
炎症和免疫反应。
相关基因聚集在具有相干生物学功能的一致轨迹组中-包括细胞外基质调节、未折叠蛋白结合、线粒体功能以及炎症和免疫反应
these gene sets show
~similar expression across tissues, difering only in the amplitude and the age of onset
of expression.
~ 这些基因集在组织中表现出相似的表达，仅在表达的幅度和起始年龄上有所不同
~Widespread activation of immune cells is especially pronounced, and
is frst detectable in white adipose depots during middle age
~ 免疫细胞的广泛激活特别明显，在中年白色脂肪库中是最常见的
Single-cell RNA
sequencing confrms the accumulation of T cells and B cells in adipose tissue—
including plasma cells that express immunoglobulin J—which also accrue
concurrently across diverse organs.
~ 单细胞RNA测序证实了脂肪组织中T细胞和B细胞的积累-包括表达免疫球蛋白J的浆细胞-这些细胞也同时在不同的器官中积累。
Finally, we show how gene expression shifts in
distinct tissues are highly correlated with corresponding protein levels in plasma,
最后，我们展示了基因在不同组织中的表达变化如何与血浆中相应的蛋白质水平高度相关
thus potentially contributing to the ageing of the systemic circulation.
从而可能导致系统循环的老化
Together,
these data demonstrate a similar yet asynchronous inter- and intra-organ
progression of ageing, providing a foundation from which to track systemic sources c
of declining health at old age.
这些数据共同显示了一种类似的但非同步的器官间和器官内衰老进程，为跟踪老年健康下降的系统性来源提供了基础。
衰老会引起器官的功能衰退，扰乱复杂的串扰，而串扰对于维持健康的生物体过程至关重要。 虽然单个器官类型按年龄转录分离(图1c)。
我们对这些器官之间的衰老缺乏基本的比较理解，包括衰老的开始和速度的差异。 因此，我们进行了配对差异表达，以确定差异表达基因(DEGS)何时出现，以及它们是否随着年龄的增长而持续存在。
虽然在邻近年龄的器官之间观察到少数DEGS，但在大多数器官中，相对于3个月大的成年人，老年小鼠的DEGS数量明显增加，这表明基因表达的渐进性、渐进性变化只有在足够的时间后才能检测到(图1d,e)。
有些器官，如胰腺和骨髓，似乎对衰老后基因表达的变化相对不敏感；这可能部分地解释了由于数据集中的老化而导致的相对较小比例的全局方差扩展数据图。 (1a，b)
虽然衰老小鼠的核心轮廓相对于6个月大的小鼠保持，但与仍在发育中的1个月大的小鼠的器官相比，DEGS的数量大大增加(扩展数据图。 2a-c)。
明显的离群点是脾脏spleen,，它显示了大量与细胞周期和血细胞发育有关的DEGS，甚至到了中年（数据未显示）。 值得注意的是，DEGS在SCAT和GAT中出现在中年，在DEGS出现在其他器官之前(图1d。扩展数据图。 2d)。
这些可能与已知的脂肪组成随年龄的变化有关，特别是在免疫细胞浸润方面。 一些器官，如肠系膜脂肪和它附着的小肠，在生命后期才发生急性和明显的基因表达变化。 为了独立地确认我们的观察，我们为每个器官生成了自组织映射，以便能够可视化相关基因节点5(扩展数据图。 3a)
不仅全球老化节点出现，白色脂肪组织再次表现出强烈的老化特征，内脏GAT和MAT的结构高度相似。 性也会影响器官功能，导致人类不同的衰老和疾病结果。 我们观察到GAT、SCAT、肝和肾的显著性别效应，这可能与脂肪储存、性激素调节和肾血流动力学7-9的已知差异有关(扩展数据图。 1c，d，3b)。
性别在每个年龄的差异基因表达分析表明，这四个组织在整个寿命中始终显示出最多的DEGS(扩展数据图。 4a，b)
年轻（3个月)和老年(18个月）性别之间的大量重叠表明，这些差异是早期建立的，并在整个生命中保持(扩展数据图。 4c，d)
然而，构成这些性别DEGS的生物途径与构成老化DEGS的生物途径很大程度上不同，因此没有提供任何证据表明性别差异影响我们在这里观察到的转录剖面(扩展数据图。 4e-h)。
接下来，我们询问早期DEGs是否随着年龄的增长而持续存在，或者它们是否在老年时让位于新的DEGs。 例如，在骨中，骨化基因的早期表达随着骨形成的完成而减少，这些基因与晚期DEGS高度相关，后者的表达增加，典型的年龄相关的骨丢失（补充表1）。
总的来说，大多数器官表现出早期和晚期DEGS之间的相关性，这在GAT、肝、肾和心脏中几乎每一种两两比较都是例证（补充表1）
很少有基因是任何个体年龄特有的，器官特异性大于年龄特异性(图1。 1f)
衰老器官之间常见的差异表达特别令人感兴趣，因为普遍存在的衰老途径可能提供新的治疗机会。 当我们分离出最常见的不同器官表达的基因时，我们发现与免疫反应途径有关的基因有很强的富集作用(图1。 1G，扩展数据图。 2e-h，补充表2)
值得注意的是，J链(也称为Igj)的表达-编码血浆B细胞标记免疫球蛋白J-在17个器官中的11个终生持续增加(图1。 1g-k)。
生物钟基因Bhlhe40、Bhlhe41、Arntl、Npas2、Per3、Ciart和DBP也是顶级DEGS的特征(Extended Data Fig. 2h)
与年龄相关的昼夜节律紊乱是众所周知的，但这些数据可能突出了昼夜节律在健康下降中的未被重视的、全有机体的作用。 事实上，生物钟失调被认为会导致代谢和炎症紊乱，并缩短寿命。
基因表达动态随年龄的变化
配对比较本质上是有限的，我们的数据使我们能够检查基因表达动力学与高时间分辨率的整个寿命。 为了揭示整个生物体的过程，我们首先寻找基因表达轨迹贯穿整个生命周期，器官之间具有共同的行为。 我们计算了所有17个器官中每个基因的平均轨迹，并对这些平均轨迹进行了聚类，揭示了衰老特征的功能富集，如炎症增加、线粒体功能障碍和蛋白质平衡丧失(图2a。 补充表3、4)
值得注意的是，这些特征具有明显的动态模式。 例如，第3组在整个寿命内线性下降，并对线粒体基因有很强的富集作用，而第7组-编码对蛋白质折叠很重要的热休克蛋白-显示了仅从12个月大开始的急剧下降。 这与第8组形成鲜明对比，第8组含有细胞外基质基因，这些基因在6个月前迅速下降，在6个月后逐渐下降。 编码免疫反应途径的基因在簇4和6中具有特征；簇4基因如β-2微球蛋白(B2m)和Igj的表达在整个生命中稳步增加。 相反，簇6的免疫基因的表达-如CD74和补体C1QA-表现出非线性增加，在9至15个月之间有一个平台。每个簇包含具有相似全局轨迹的基因，但这些轨迹的相位和大小的器官特异性差异表明，相似的过程具有独特的动力学。 对于每个聚类，我们分配了一个振幅指数(1个月至30个月期间平均轨迹z得分的绝对变化)和一个变异性指数（衡量平均轨迹的传播）(图。 2b
这表明，振幅最大的簇也表现出最强的器官特异性行为，脂肪组织突出表现在簇4和6（免疫反应)、簇7(蛋白质折叠)和簇8(细胞外基质）(。 2c)。
当器官被独立分析时，与免疫反应途径相关的基因的终生表达增加尤为明显，特别是对于脂肪组织，如GAT(图2d-g，扩展数据图。 5、6，补充表5
事实上，细胞因子介导的炎症通路(如GO：0019221)的基因在GAT中的表达明显增加，从18个月开始(扩展数据图。 7a，补充表9)
这包括Ccl8，在大多数组织类型中显示出非常高的相关性(扩展数据图。 7b)
值得注意的是，尽管许多下游过程是跨器官共享的(图。 2a)
转录因子调控网络几乎没有重叠（补充表6，9）。
此外，虽然组织特异性轨迹簇(扩展数据图。 5)
表明，几个转录因子基因在组织之间是常见的-例如在肾脏、肺和心脏中的Irf1-这些簇在组织之间的行为往往不同，或者富集于不同生物途径的基因（补充表7）。
因此，似乎即使组织之间出现了共同的生物途径，但这些途径在很大程度上不是由共同转录因子调控网络的潜在变化驱动的。 当然有可能更远 调节元件-包括增强子或超级增强子-可能提供一个缺失的环节，预计这种调节元件可以在未来的研究中进行分析。
RNA测序证实血浆B细胞浸润
从整个器官的转录过程中出现的一个基本问题是，观察到的基因表达的变化是由随着年龄的增长而发生的细胞内在变化驱动的，还是由细胞组成的变化驱动的。 利用单细胞RNA测序(scRNA-seq)获得的衰老小鼠数据库TabulaMurisSenis2，我们首先询问来自散装RNA-seq（补充表8）的与年龄相关的顶级基因是否特定于单个细胞类型，或在多种细胞类型中广泛表达。 对于每个组织中的每个基因，我们根据表达该基因的细胞在单细胞数据中的分布分配了一个分散评分(图。 3a-c)
例如，在肾脏中，乌头酶基因Aco1和Aco2-以及柠檬酸合酶(Cs)与年龄呈负相关，并在多种细胞类型中表达，显示线粒体功能的器官范围下降(扩展数据图。 8a-f)。
其他基因，如ms4a7，与年龄呈正相关，但仅在肾巨噬细胞中表达(图1。 3a-c)
这是许多其他上调的炎症基因的特点，这些基因是特定于这些细胞(扩展数据图。 8b)。
除了分散评分外，我们还使用了来自TabulaMurisSenis两个数据集的具有细胞类型特异性基因表达谱的反褶积软件-荧光激活细胞分选(FACS)与Smart-seq2数据(表示‘FACS’)和基于微流控滴滴的scRNA-seq数据（表示‘液滴’）-以估计年龄11的每个组织中细胞类型丰度的变化(扩展数据图。 8h)。
虽然用这两种方法捕获的细胞类型和轮廓并不总是重叠的，但在这九种情况下，两种方法都发现相同的细胞类型随着年龄的增长而显著变化，效应大小大于0.5，两者之间的相关性是高度一致的。 在GAT和肝脏中，随着年龄的增长，B细胞的数量大量增加，提供了进一步的证据，证明免疫细胞的积累是整个器官炎症信号的驱动因素。 此外，四种方法(FACSSCRNA-seq、液滴SCRNA-seq、FACS体积反褶积和液滴体积反褶积)的细胞组分表现出很强的一致性，表明结果是高度稳定的(扩展数据图。 8g)。
最后，正如TabulaMurisSenis所证明的，不同丰度的变化组合 细胞类型和细胞内基因表达的变化在大多数组织中都存在；然而，总的来说，细胞类型的组成似乎更重要。 细胞类型组成随年龄的变化，特别是免疫细胞在内脏脂肪等组织中的积累，已经得到了很好的证实。 然而，缺乏时间和细胞特异性分辨率。 鉴于内脏脂肪的扩张预测发病率和死亡率12，我们的目的是通过使用来自TabulaMurisSenis的单细胞转录数据来发现与年龄相关的脂肪炎症特征的起源。 我们发现随着年龄的增长，性腺脂肪组织中的T细胞和B细胞数量增加，包括一组独特的CD79B细胞，这些细胞仅存在于老年小鼠中(图3d，e)
这与适应性免疫应答基因在整个器官中的表达增加是一致的(图2a，g)
在这一群体中富集的基因的无偏筛选显示了高Igj表达(图3f。 补充表11、13)。
考虑到我们观察到Igj在17个器官中的11个器官中的差异表达(图1g。
我们分析了成千上万的CD79 跨器官的B细胞，揭示了FACSCRNA-seq和液滴数据集中Igjhigh细胞的独特簇，与血浆B细胞标记物Xbp1和Derl3的高表达相一致(图 3G，扩展数据图。 9a，b，f，g
相对于Igjlow细胞，这些细胞显示与未折叠蛋白反应和内质网应激途径有关的基因表达增加，这是高分泌血浆B细胞13的特征(图3h，扩展数据图。 9c，补充表12、14)。
值得注意的是，这些血浆B细胞几乎完全来源于老年小鼠，并在不同的器官中积累(图 3i-l，扩展数据图。 9d，e，h，补充图 1)。
利用全器官数据集的高时间分辨率，我们还通过Igj的表达在整个生命周期中追踪这些细胞。
我们观察到骨髓、骨和脾-负责产生适应性免疫细胞的器官中Igj的初始增加(扩展数据图。 9i)。
值得注意的是，Igj和Derl3的表达随后在GAT和肾脏中增加，在BAT、心脏和肺Igj增加之前，大约12个月的年龄。 人内脏和皮下脂肪(基因型-问题表达(GTEx)数据中IgJ的表达也增加；扩展数据图。 9j)。
我们在这里观察到的编码趋化因子信号和细胞表面受体和配体的基因表达的变化可能可以解释这种差异积累。 然后，我们利用scRNA-seq数据重建了B细胞受体位点，发现Igjhigh浆细胞主要属于IgM类(扩展数据图。 9k)
值得注意的是，我们检测到几个克隆存在于不同的组织中，这表明这些细胞被贩运到来自共同来源的组织中(扩展数据图。 9l)
这些细胞的作用，或者它们产生的抗体的特异性，目前尚不清楚，但人们很容易推测，它们可能有助于全球范围内的自身抗体的增加，据报道，这些抗体发生在衰老过程中。
血浆蛋白与器官mRNA的相关性
单独研究器官可以揭示详细的衰老过程，甚至是可能容易受到干预的常见表型。 然而，衰老是系统地发生的，一个器官的衰退可能会刺激或加速全身的功能障碍。 在一定程度上，这可能是由于血液传播因素的改变，介导细胞间和器官-器官的沟通。 受异时周期旁分裂实验的鼓励， 我们和其他人已经发现血浆蛋白是有害的
或者在衰老的大脑、肌肉、胰腺、骨骼和其他器官中恢复功能17，以及数百种与人类衰老相关的蛋白质，这些蛋白质与认知和握力等特征有关。 然而，这些因素的起源在很大程度上仍然未知。 在这里，我们试图确定哪些器官有助于血浆蛋白质组的年龄相关变化，通过将血浆蛋白年龄轨迹与其在每个器官中的相应基因表达轨迹相关联(图。 4a，b)。
这一分析揭示了至少一个器官中25种血浆蛋白(Spearman相关系数ρ>0.6)与基因表达相关，共35个独特的血浆蛋白/器官对。 我们发现了一些高相关性，如肾中血管细胞粘附分子1(VCAM1)和脾脏成纤维细胞生长因子10(FGF10)，以及脑中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)等其他显著对。 特别令人感兴趣的是VCAM1和骨膜素(POSTN)，它们在几个器官中都表现出特殊的相关性(图1。 4c-j)。
最近，VCAM1被认为是老年血浆19脑衰老的关键介质，脂肪组织中POSTN的丢失导致脂质代谢受损。 此外，两者都与细胞外基质调节和纤维化疾病有关，可能表明年龄相关的纤维化。 在本研究中，Throbospondin-4(THBS4)的水平随着年龄的增长而降低，并与肌肉中的基因表达高度相关，最近被证明能促进突触的形成，并在年轻的血液中富集。 值得注意的是，白色脂肪组织也出现在这一分析中，5种血浆蛋白与内脏MAT和GAT中的基因表达高度相关，3种在SCAT(图 4a)。
在肢体肌肉中，有少量的DEGS，七种血浆蛋白在整个生命周期内与基因表达相关，包括POSTN、骨形态发生蛋白-1(BMP1)、基质金属蛋白酶-2(MMP2)和其他与细胞外基质相关的蛋白质(扩展数据图。 10a)。
这种细胞外基质相关蛋白构成了我们鉴定的25种血浆蛋白的大多数(扩展数据图。 10b)
虽然这些发现是有趣的，血浆蛋白的丰度可能独立于基因表达的差异而改变。 例如，组织可能会优先释放更多的某些蛋白质随着年龄的增长。 此外，一些组织缺乏年龄相关性，但表现出高表达的基因编码血浆蛋白（补充表10）。
未来的研究将确定这些基因表达的变化是否有助于血浆蛋白质组中与功能相关的年龄差异，或者它们是否介导免疫细胞粘附和浸润等其他过程。
Discussion
我们的数据集为小鼠整个生命周期的所有主要器官提供转录组和血浆蛋白质组的时间分辨率，并可作为许多学科生物学家的基本资源。 我们发现基因表达轨迹与先前发现的有害过程一致，如线粒体功能障碍、蛋白质折叠受损和炎症。 此外，中年出现的DEGS与晚年的DEGS高度相关，表明这些有害过程在不同器官中早期出现。 随着衰老细胞消融(Senolytics)、营养感知操作（通过雷帕霉素和二甲双胍治疗）和血浆蛋白质组改变等恢复策略的迅速进展，我们需要更好地了解在哪里和何时应用这些疗法22。
事实上，这里观察到的共同老龄化模式可能有助于解释这种干预措施对健康的深远好处。 总之，这种全有机体对衰老动力学的表征可能会加速治疗学的发展，而对昼夜节律紊乱、血浆细胞积累和脂肪下降的洞察则是重新关注的途径。
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任何方法、附加参考资料、自然研究报告摘要、原始数据、扩展数据、补充信息、确认、同行评审信息；作者贡献和竞争利益的详细信息；以及数据和代码可用性说明可在https://doi.org/10.1038/s41586-020-2499-y.查阅
Methods
小鼠和器官收集
样本量随机化和致盲
研究前未进行样本量选择。 在小鼠解剖顺序和96孔板的制备过程中进行随机化，用于cDNA的产生。 没有进行致盲：作者在整个研究过程中意识到了所有与数据和元数据相关的变量
RNA的分离和制备
用研钵和杵在液氮上粉碎冻骨和皮肤。 冷冻的整个器官，或压碎的骨头或皮肤，被放置在TRIzol中，并立即用组织破坏器在50毫升锥形烧瓶中均匀化（器官特异性细节见补充表15）。 匀浆中的碎片在12，000克的1.5毫升管中，在4°C下，放置5分钟。 然后将上清液转移到一个新的1.5毫升管中，加入氯仿。 在最大速度上涡旋10s后，将样品转移到1.5ml或2ml相锁凝胶管中，在12，000g旋转5分钟之前，在4°C下加入水。 然后将水相转移到一个新的管中，在加入异丙醇后，混合物以最大速度涡旋10s，然后根据制造商的指示通过RNeasy柱，并与指定的水体积洗脱。 然后用纳米滴定量RNA，并在−80°C处冷冻。
cDNA合成、文库制备、测序和数据处理
方法包括使用Smart-seq2协议23进行cDNA合成、使用内部版本Tn524，25进行文库制备、文库池、质量控制、测序和数据处理https://doi.org/10.17504/protocols.io.2uvgew6.
质控及差异表达分析
Plasma proteomic analysis
血浆蛋白质组学分析
The SomaLogic platform索马逻辑平台主要用于检测和测量人类蛋白质。 为了减少跨物种效应对我们分析的影响，我们首先在我们的数据集中确定了小鼠和人类之间具有高度进化保守性的蛋白质。为此，我们从MGI(http://www.informatics.jax.org/)下载了包含鼠标和人类之间所有同源性的纯文本文件以及每个物种的序列标识符(HOM_MouseHumanSequence.rpt)。 接下来，从UniProt(https://www.uniprot.org/)下载了人类和小鼠的参考蛋白序列)。 使用R“Biostring”库，在人和小鼠序列之间进行了全局成对序列比对。 在整个比对中，只有 identity为80%的序列被包含在下游分析中。
为了确定年龄对血浆蛋白质组的影响，对Somalogic提供的相对荧光单位(RFU)进行了log10转换，并采用了年龄和性别调整的线性模型。 第二类平方和(SS)是用R包car33计算的，Q值是用Benjamini-Hochberg方法34估计的。
由Somalogic平台测量的原始蛋白质丰度数据在计算每个采样年龄时间点的所有复制的中位数之前进行了缩放(z转换)，以获得平均轨迹。 对每个组织进行DESeq2预处理后的归一化RNA-seq计数进行了相同的转化。 为了比较血浆蛋白的变化与mRNA在任何组织中表达的变化，我们分别计算了给定蛋白质轨迹与其对应基因在每个组织中的表达轨迹之间的成对Spearman秩相关系数。 因此，给定的蛋白质可以与多个组织的表达变化相关。 为了将我们的分析限制在反映强烈变化的mRNA/蛋白质对上，我们过滤得到的mRNA/蛋白质相关性如下：（1)该蛋白必须在人与小鼠之间显示至少75%(770个蛋白质)的序列同源性）。 （2）根据线性模型分析，蛋白质必须随年龄变化显著(Q<0.05；115种蛋白质)。 （3）在3个月大的小鼠和任何连续的时间点(Q<0.05；95种蛋白质)之间的至少一对比较中，相应的基因必须在给定的组织中差异表达)。 （4）mRNA/蛋白质图谱必须显示Spearman的等级相关性至少为0.6（25个蛋白质；35个蛋白质/基因对）。
采用Benjamini-Hochberg对每个组织进行校正，以评估蛋白质/mRNA图谱相关性的意义。 鉴于基因可以在不同的组织水平上表达，我们还计算了每个基因的平均mRNA表达等级。 为此，我们根据DESeq2中的碱基均值，对每个组织的一个给定基因进行平均mRNA表达排序。
利用自组织图谱分析基因表达与衰老的相关性
对于每个基因，根据表达和年龄计算组织级Spearman的等级相关系数。 同样，我们计算了斯皮尔曼的等级相关系数的表达和性别。 然后对得到的相关矩阵进行过滤，从而只考虑与任何组织中的年龄或性别显著相关的基因(P<0.01后，假发现率(FDR)调整与Benjamini-Hochberg程序34)。 然后使用该矩阵创建一个具有Kohonen R包(v.3.0.8)36的自组织映射(SOM)5。 除了Spearman的秩相关系数来比较基因表达和性别外，我们还测试了其他措施，例如从单边Wilcoxon秩和检验(同时测试“更大”和“更少”的选择，如果“更大”的选择产生较低的P值，则翻转符号)和Somers‘D。 由于不同的方法给出了相似的结果，我们继续使用Spearman的性别和年龄相关性来获得更好的可比性。
组织和年龄基因表达的特异性
为了确定一个基因是如何在某个时间点或在某个组织中表达的，我们使用了一种从基因集分析中知道的方法，即所谓的基因集富集分析(GSEA)。 我们没有计算一个生物类别在分类的基因列表中的富集程度，而是计算了每个基因中某一组织、年龄或一对组织/年龄的富集程度。 对于每个基因，我们计算了10个年龄的10个富集分数，17个组织的17个富集分数和它们的组合的170个富集分数。 特异性定义为所有组织、时间点和组合的最大富集和第二最大富集之间的差异。 差异越大，组织、时间点或其组合的基因就越特异。 值得注意的是，最大富集分数可以转化为P值-例如，通过随机抽样。 然而，为了更好的可比性，我们直接给出运行和，而不将它们转换为P值。 在这里，该方法被称为样本集富集分析(SSEA)。
根据元数据估计数据的方差
为了估计数据中的差异取决于年龄、组织或性别，我们使用了主方差分量分析(PVCA)，如在生物导体包pvca中实现的那样。 将主成分分析和方差成分分析(VCA)的强度结合起来)。 最初，它被用于量化微阵列数据中的批处理效应。 然而，在我们的例子中，我们不提供实验批次，而是提供一组元数据作为输入。 人类转录数据：人类基因表达数据来源于GTEx门户网站(http://www.gtexportal.org/)。 从GTEX分析v7(GTEx_Analysis_2016-01-15_v7_RNAS EQC v1.1.8_gene_reads.gct)的读取计数用纱线37归一化。
单细胞分散评分
我们首先从TabulaMurisSenis中筛选出具有500多个不同基因和50k读取的FACS细胞。 由于雌性小鼠的复制次数较少，我们只考虑了4只3个月大的雄性小鼠和4只24个月大的雄性小鼠。 然后，我们创建了日志(百万分之一计数(CPM))，转换了每个组织的单细胞计数矩阵，从每个组织的数据中计算出一个16维的PCA，并使用PCA组件将每个细胞嵌入到一个16维的潜在空间中。 请注意，PCA的维数是根据每个分量的解释方差来选择的。 对于每个组织中的每个基因，我们选择那些表达它的细胞(log(1cpm)>0)，并计算它们在单细胞潜在空间中的加权中心，其中我们将归一化基因表达值视为权重。
最后，我们定义了系统分析基因表达的方法：我们计算了每个组织的每个基因的Spearman相关性，其体积DEseq2归一化基因表达随年龄的增长。 然后，我们根据Spearman的秩相关系数绘制了每个体老化DEG的单细胞色散。
细胞内在基因表达与细胞丰度的关系
我们首先从TabulaMurisSenis中选择了具有500多个不同基因和50k读取的FACS细胞。 由于雌性小鼠的复制次数较少，我们只考虑了雄性小鼠的数据。 然后，我们使用日志(1cpm)转换数据，并分别考虑每个组织，我们将这些细胞分为年轻(≤3个月；Y)和老年(>3个月；O)。 对于每个基因，我们计算了细胞计数和读取计数在Y和O之间的log2折叠变化，其中细胞计数被定义为表达该基因的组织内细胞的分数(log(1cpm)>0)，读取计数被定义为表达该基因的细胞中基因的平均读取计数。 接下来，我们分析了大量数据中的每个基因，首先计算了Spearman对DESeq2归一化基因表达与年龄的相关性。 然后，我们将基因结合到那些随着年龄的增长(Spearman>0.7；I)和随着年龄的增长(Spearman<0.7；D)。
最后，我们比较了单细胞log2Y与O细胞，并通过运行Wilcoxon-Mann-Whitney检验将计数与体积相关I和D进行读取，以确定基于单细胞数据的细胞或读取计数的变化是否分离了体积组I和D。然后，我们分别绘制了液滴和FACS单细胞数据的每个组织的相应P值的读取和细胞计数U统计量
Deconvolution with CIBERSORTx
我们首先使用CIBERSORTx11的签名矩阵创建特性，它使用带注释的单细胞数据检测细胞类型特异性签名基因。 作为输入，我们使用来自每个年龄的TabulaMurisSenis的男性细胞分别从FACS和液滴数据中创建组织特异性签名矩阵。 与手稿中使用的细胞选择标准一致，我们选择了500多个不同基因和5k读取的液滴细胞，500多个不同基因和50k从FACS细胞中读取。 我们输入没有日志变换的单细胞归一化cpm数据，以及用于执行反褶积的cpm散装组织数据。 由于高技术方差的可能性，在S模式下进行了反褶积，所有其他参数都设置为默认参数，所得推断的细胞类型分数与年龄相关，使用Spearman的秩相关
