文献分享--空间转录组图谱揭示微塑料致肝毒性中Ppara与Anxa2的相互作用

作者，Evil Genius

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知识积累

微塑料（MPs）正日益被视为一项紧迫的全球健康问题，越来越多的证据表明其生物蓄积性与慢性疾病风险相关。肝脏作为代谢稳态和解毒的核心器官，对持续性的微塑料暴露尤为敏感。

背景与问题

塑料已深度融入人类生活，但因其难以降解，在光照、热力和机械力作用下会裂解为微塑料（粒径1–5000 μm）。

微塑料已广泛存在于海洋、淡水、土壤和空气中，人类通过吸入、摄入和皮肤接触持续暴露。

已在人体血液、睾丸、胎盘等多种样本中检出微塑料，聚乙烯（PE）是其中最常见的一种。

健康关注点

微塑料在体内的累积引发健康担忧，尤其对肝脏影响显著。

肝脏是代谢和解毒核心器官，微塑料可诱发炎症和先天免疫反应，扰乱脂质代谢，促进代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）的发生发展。

核受体（NR）与PPARα的作用

核受体（如PPARα）是调控肝脏代谢、炎症和解毒的关键因子，其信号紊乱与MASH相关。

PPARα激活可缓解肝脂肪变性和炎症，是潜在治疗靶点，但环境因素（如微塑料）如何干扰其信号尚不清楚。

研究空白与本工作

以往研究多采用整体转录组测序，缺乏单细胞和空间分辨率的视角。

本研究利用10X Genomics Xenium空间转录组平台，在单细胞水平结合肝脏空间结构信息，系统研究PE暴露对小鼠肝脏基因表达的影响。

重点揭示了PE诱导的空间异质性细胞组成变化、炎症相关微环境，以及核受体驱动的基因程序。

特别发现，PE暴露调控核受体信号通路，并鉴定出Ppara作为关键调控因子，调节Anxa2（参与损伤应答和组织修复的基因）。

结果1、体内暴露于PE微塑料诱导雄性小鼠肝毒性

为鉴定具有肝毒性的微塑料类型，首先在原代肝细胞中测试了多种微塑料，包括PE、PS、PET、PP、PVDC、PA-6和PVC，暴露24小时后发现PE导致细胞活力最低，具体实验条件和微塑料规格见材料与方法部分。

为研究PE在体内对肝毒性和代谢功能障碍的影响，野生型（WT）小鼠分别饲喂普通对照饮食（CD）或高脂、高果糖、高胆固醇的代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）诱导饮食（MD），并同时进行PE口服灌胃。

体重变化：饲喂CD并灌胃PE的小鼠，体重较溶剂对照组逐渐增加，从每日灌胃（2 mg/天）第7周起差异显著，并持续至实验结束。MD组小鼠体重和肝脏重量均显著高于CD组，但PE处理并未使MD组体重进一步增加。

肝脏重量与血糖：PE处理在CD或MD组中均未导致肝脏重量增加，而各组间体重的显著变化与血糖水平无关。

肝损伤指标：PE处理使CD组和MD组的血清ALT水平均升高，提示肝损伤加重；MD+PE组肝脏甘油三酯（TG）水平较MD组进一步升高。

组织病理学：采用MASLD活动度评分评估疾病严重程度，显示PE处理组肝脂肪变性加重；与单纯CD组相比，PE处理组的肝细胞气球样变和炎症也呈上升趋势。

综合结论：连续8周PE灌胃可在雄性小鼠中诱导肝毒性，并加重饮食诱导的脂肪性肝炎。

结果2、MD饮食和PE暴露后，小鼠肝脏中脂质代谢相关基因表达显著失调

bulk 转录组测序。

转录组整体差异：主成分分析（PCA）图显示各实验组间转录组谱明显分离。差异表达基因（DEG）分析鉴定出：PE单独改变600个基因，MD单独改变1437个基因，MD+PE组与MD组相比有279个基因差异表达。

PE特异性DEG：在CD背景下，PE特有改变503个基因；在MD背景下，PE特有改变182个基因；两者共有97个基因。CD组中，PE下调的基因包括Angptl8、Acp3、Lepr、Hmgcr，上调的包括Cyp4a12a、Cyp26b1、Gadd45g、Prkcb。

脂质代谢基因受显著影响：在重叠DEG中，脂质代谢调控基因明显受影响，包括上调（如Plin4、mt-Nd6、Cyb5a、Fubp3）和下调（如Pnpla3、Acly、Me1、Fasn），进一步凸显PE在肝脏转录失调中的作用。MD与PE联合暴露还影响胆固醇合成（如Tm7sf2、Ldlr、Mylip）、代谢功能（如Pask、Oit3）和炎症（如Nkap）相关基因。

核受体（NR）变化：MD和PE暴露显著刺激了Ppara和Nr1i3的表达，这两个基因分别是毒理学和外源物应答的关键调控因子，提示NR在肝脏应对MD和PE损伤中发挥核心作用。

通路富集分析（GSEA）：不仅MD+Veh vs CD+Veh有显著富集，PE在CD和MD两组中诱导的富集模式均与脂质代谢调控和肝毒性密切相关。MD+PE组表现出最显著的毒性相关通路诱导，反映肝应激的复合性加剧。

NR表达谱整体变化：处理组肝脏中NR表达相对于对照组在条件和样本水平均发生显著偏移，在MD组中尤为突出，提示MD和PE对NR表达失调和肝功能存在协同效应。

跨数据集比较：将本PE数据与已发表的PS暴露小鼠肝脏转录组数据（GSE245069）进行比较，发现多个NR表达变化趋势一致，包括Ppara上调和Esr下调，表明不同类型微塑料对NR表达既有共性影响，也有各自特性，反映了微塑料暴露与基因调控之间的复杂相互作用。

结果3、MD和PE对肝脏组织影响的空间单细胞转录组图谱分析

利用Xenium平台在细胞和亚细胞水平进行了空间单细胞RNA表达谱分析，以进一步描绘肝脏中实质细胞与非实质细胞之间复杂的空间动态关系。基于成熟的细胞标志物，鉴定出15个不同的细胞cluster，并观察和可视化了各cluster的空间分布及其相对比例。

细胞比例变化：细胞比例分析显示，各实验组间肝脏细胞组成存在轻微变化。具体而言，通过beta回归检验发现，PE处理组中肝小叶中间区（midlobular）肝细胞的比例显著增加。这为细胞景观提供了初步概览，而区域转录组改变及其调控机制将在后续空间和机制分析中深入探讨。

Kupffer细胞亚型解析：值得注意的是，Xenium的RNA检测灵敏度足以将对照组的Kupffer细胞区分为Trem2⁺（活化） 和Trem2⁻（非活化） 两个亚群。

肝细胞分区特征：对照组肝细胞使用分区特异性标志物进行表征——Sds标记门脉周围区（periportal），Hmgcs2标记中间区（midlobular），Glul标记中央静脉周围区（pericentral）。其他基因也表现出类似的分区特异性模式。

分区生物学功能验证：通路分析进一步验证了各注释肝区独特的生物学特征，例如中央/中间区肝细胞富集脂质生成相关通路，而门脉区肝细胞则富集胆汁酸稳态相关过程。

核受体（NR）表达图谱：综合分析了对照组小鼠15种肝细胞类型中48个NR的表达情况，结果显示各细胞类型具有独特的NR表达模式，突显了它们在协调基因表达程序中的重要作用。

结果4、PE微塑料诱导肝细胞核受体（NR）表达的显著变化

空间伪整体（spatial pseudo-bulk）基因表达，发现其与匹配小鼠样本的整体RNA-seq表达数据呈强正相关，表明Xenium的检测结果与整体测序结果一致，同时保留了亚细胞分辨率。

细胞类型特异性DEG分析：与整体RNA分析一致，我们在CD+PE和MD+PE组中，针对15种细胞类型分别鉴定了差异表达基因（DEG）。值得注意的是，MD喂养组中DEG数量显著高于CD喂养组。在MD条件下由PE独特诱导的DEG（排除CD中PE也改变的基因）在全部细胞类型中均有鉴定，其中关键基因包括Me1、Anxa2和Ppara。

肝细胞亚群分析：我们接下来聚焦于肝脏中最主要的细胞类型——肝细胞，以探索条件特异性转录变化和分区相关模式。结果发现，核受体成员基因Ppara和Nr1i3（CAR） 在各实验组的肝细胞亚群中，在样本水平和细胞水平均呈现不同的表达模式（图4E，表S10–S12）。此外，在MD+PE条件下，Kupffer细胞中的Ppara和Nr1i3表达显著上调。

NR全谱分析：我们对各细胞类型的NR表达进行了全面分析，发现了不同细胞类型特有的NR表达特征，提示NR在介导细胞特异性代谢应激和PE暴露反应中发挥独特作用。

通路富集分析（GSEA） ：使用NR模块、脂质代谢和毒性相关基因集进行GSEA，以评估PE在不同细胞类型中的效应。结果显示，无论饮食如何，PE暴露组均表现出显著富集；但CD组和MD组之间未见显著差异。这些发现可能为PE作为肝细胞肝毒性驱动因子提供潜在的分子基础。在其他细胞类型中也观察到类似趋势，且在MD和PE联合作用下富集程度最高。

结果5、空间转录组图谱揭示肝脏细胞组成与炎症程度之间的关系

除常规H&E染色外，空间转录组图谱不仅使我们能够识别整体病理信号活性，还能在保留亚细胞分辨率的同时，精确定位这些信号在其原始组织构架中的热点区域。例如，在MD+PE肝脏样本中检测了Glul（中央区）、Cyp7a1（中间区）和Sds（门脉区）的表达。

炎症相关基因C3的表达：为深入探究PE相关的肝损伤，我们检测了炎症相关基因C3的表达，发现CD+PE、MD+Veh和MD+PE组的C3表达均高于CD+Veh组。进一步确认MD+PE样本中C3在特定区域富集表达。

炎症热点区域的鉴定：鉴于肝脏中央/中间区对损伤更敏感，我们通过一组炎症替代基因标签（包括Alox5ap、C3、Dnase1l3、F3、Hp、Nupr1、Reg3g、Ccr7和Il6）对所有样本进行分析。基于分箱（binning）和聚类的空间分析在各处理样本中均鉴定出高炎症和低炎症区域。

细胞多样性与炎症的负相关：我们进一步利用Shannon指数分析细胞多样性，以确定各处理如何影响肝细胞群体动态，特别是在中央区和中间区。值得注意的是，在MD+PE处理的肝脏样本中，炎症基因标签表达与细胞多样性之间呈负相关（R = −0.52），且这一趋势在所有实验组中一致。

细胞类型比例变化：统计分析显示，与CD+Veh相比，MD+PE组小鼠中非实质细胞（包括Kupffer细胞、星状细胞和淋巴细胞）的比例显著降低；而实质细胞中，中间区肝细胞的比例在MD+PE组中略有增加。

Kupffer细胞功能变化：鉴于Kupffer细胞是肝脏中最早的损伤应答者，我们发现其功能活性相关基因也受MD和PE处理影响。通过三组比较，鉴定出空间聚类Kupffer细胞（定位于中央/中间区）中的DEG，其中28个基因为MD+PE条件所特有，且这些基因与脂质诱导的凋亡细胞吞噬显著相关，提示Kupffer细胞积极参与受损/凋亡细胞的清除。

肝细胞区域特异性基因：鉴于中央区对损伤更敏感，我们应用相同分析方法，鉴定出MD+PE组特有的10个基因。其中，Anxa2仅在MD+PE处理样本的高炎症区域中央区肝细胞中富集表达，而中间区和门脉区肝细胞共有Slc4a4等富集基因。

PE颗粒的空间检测：采用两种正交方法——显微拉曼光谱和光学光热红外（O-PTIR）光谱——在肝组织中空间检测PE颗粒。拉曼分析在MD+PE样本的Xenium载玻片上检测到PE颗粒，而MD+Veh对照组未检出。与Xenium空间转录组数据整合后，显示PE定位与暴露响应转录程序存在空间相关性，包括PE阳性区域靠近Kupffer细胞。O-PTIR分析在连续切片中独立验证了MD+PE组织中PE的特征化学信号。

结果6、中央区肝细胞中Anxa2的表达与Ppara相关

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