image.png

前言

在生发中心（Germinal Center，GC）形成的过程中，滤泡辅助性T（T follicular helper，Tfh)细胞承担着重要的角色。最初，科学家们基于其特异性高表达CXCR5鉴定Tfh；随后的研究发现，Tfh细胞还高表达PD-1、ICOS以及BTLA，却不表达常见于T细胞的标识分子CD62L、CCR7和PSGL1，因而研究者们提出将Tfh与其他辅助性T细胞亚群进行区分的观点。2009年，Bcl6被确定为Tfh细胞的特异性谱系转录因子。然而，Tfh细胞的不同亚群在表型和功能上并不完全一致，虽然已经有研究揭示了其组成的异质性，但仍需进一步深入分析及验证。

记忆T细胞是免疫应答后的产物，这些细胞在无进一步抗原刺激下依旧可以存活并进行自我更新。基于其表面分子的表达及功能的异质性，记忆T细胞可分为中枢记忆（Tcm）、效应记忆（Tem）以及组织驻留记忆（Trm）T细胞。Tem细胞表达归巢受体并能分泌多种细胞因子；而Tcm细胞很少分泌效应细胞因子，但高表达CD62L和CCR7；Trm细胞则表达CD103及CD69，并特异性定位于炎症组织中。近来，通过对慢性感染及肿瘤模型的研究，研究者们已经确定了一种具有干细胞特性的CD8⁺ T细胞亚群，发现其对肿瘤治疗中的免疫检查点阻断疗法异常敏感，从而成为了潜在的免疫治疗靶点。然而，对于CD4⁺ T细胞亚群还未得到充分研究，特别是其中的Tfh细胞，对其是否、何时以及如何产生记忆细胞知之甚少。

本研究通过对几种处理条件下产生的CXCR5⁺Bcl6⁺ Tfh细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。结果显示除了已表征的PD-1^hi效应Tfh细胞亚群外，还有一个CD62L⁺PD-1^low亚群，它们独立于PD-1⁺细胞发育，不与B细胞直接接触。更重要的是，CD62L⁺ Tfh细胞表达记忆和干细胞相关基因，且具有更好的长期存活率，在再次免疫反应中也更容易产生效应细胞。因此，本项研究揭示了Tfh细胞的异质性，并为记忆Tfh细胞的发育和调节提供了新的见解。

主要内容

一、scRNA-seq分析揭示Tfh细胞的异质性

首先，作者使用10x单细胞测序平台，基于CD4⁺CD44^hiCXCR5⁺Bcl6-RFP⁺Foxp3-GFP^-B220^-圈门策略，对从KLH免疫的Bcl6^RFP×Foxp3^GFP报告小鼠中分离的活Tfh细胞进行了scRNA-seq测序。对数据进行串联及质控后，总共捕获了5410个细胞，每个细胞具有1251个中位基因。通过无监督聚类确定了10个主要的细胞群（图1A），进一步通过差异表达基因（DEGs）对每个细胞簇进行定义，簇1（C1）高表达经典的Tfh细胞标记基因，包括Pdcd1、Lag3、Hif1a、Tox、Il21、Cxcr5和Tox2，表现出常规效应Tfh细胞的特征。Sell⁺中枢记忆样（C3）、Ifit1⁺干扰素刺激（C6）、Stmn1⁺高度增殖（C5和C7）Tfh细胞亚群以前未被鉴定。由于特异性谱系转录因子的缺乏，未对C0和C2簇进行定义（图1A）。C8和C9簇可能分别是巨噬细胞和B细胞，也被排除在进一步分析之外。值得注意的是，Pdcd1和Sell在Tfh细胞中的表达是相互排斥的。Pdcd1主要表达于C1、C5和C7簇中，在C3簇中几乎没有检测到，而Sell在C3和C6簇中高度表达。

接下来，作者进一步分析C1（Pdcd1^hi）和C3（Sell^hi）中的DEGs。C1高表达许多以前被表征为在Tfh细胞产生和发挥功能中具有重要地位的基因，因此其可能代表效应Tfh细胞。而C3则高表达与记忆T细胞形成相关、参与细胞定位和迁移、抗凋亡、细胞周期抑制以及与干细胞相关的基因（图1C）。证实了Bcl6⁺ Tfh细胞可能具有异质性。

为进一步检测这些细胞的异质性的产生并不仅限于KLH免疫，作者利用相同的圈门策略，从流感感染小鼠的引流淋巴结和naïve小鼠的派尔斑(Peyer’s Patches, PP)中提取Tfh细胞，并进行scRNA-seq测序。同时通过CD4⁺CXCR5⁺Bcl6-RFP⁺Foxp3-GFP⁺门控策略对从KLH免疫的Bcl6^RFP×Foxp3^GFP报告小鼠中分离的滤泡调节性细胞(Tfr)进行类似研究。UMAP分析揭示，在KLH免疫模型中，Tfh和Tfr的细胞亚群大体保持一致（图1D）。与KLH免疫模型和流感感染模型相比较，PP模型中的Tfh细胞展现出相对较高丰度的C1以及较低丰度的C3（图1D）。此外，源于KLH免疫模型的Tfr细胞的C4簇是特异性存在的，在三种模型的Tfh细胞中均未被发现，且高表达与调节性T细胞的发育和功能有关的基因（图1D）。

为了验证上述scRNA-seq分析的结果，作者通过流式细胞术分析了KLH免疫小鼠引流淋巴结中CD4⁺CD44^hiCXCR5⁺Bcl6⁺ Tfh细胞表面PD-1和CD62L蛋白的表达情况，发现60%的GC-Tfh细胞表达PD-1，25%的GC-Tfh细胞表达CD62L（图1E、F），并且在另外两种模型中观察到类似的细胞分布模式（图1E、F）。

二、CD62L+Tfh细胞百分比随免疫应答进展而增加

上述生物信息学分析揭示了CD62L⁺ Tfh细胞亚群的存在。为了进一步表征这些细胞，作者在不同时间点，对KLH免疫后的B6小鼠中的Tfh细胞进行分析显示，PD-1⁺ Tfh细胞是免疫反应早期阶段的主要细胞群（图2A-C），而CD62L⁺ Tfh细胞的百分比随着时间的推移而增加（图2A-C），表明它们可能代表记忆细胞。作者还使用OT-II TCR转基因小鼠模型，分析了抗原特异性Tfh细胞。与KLH免疫模型相似，转移到CD45.1受体小鼠中的naïve OT-II T细胞在OVA免疫后发育成PD1⁺和CD62L⁺Tfh细胞群（图2D-F）。不同的是，PD-1+与CD62L⁺ Tfh细胞的百分比在免疫反应早期增加，在免疫反应达到峰值后均降低（图2F）。另外，可能由于scRNA-seq灵敏度的限制，Tfh细胞中的Bcl6转录因子并没有被很好的检测到，于是作者对Bcl6进行细胞内染色，发现CD62L⁺ Tfh细胞和PD-1⁺ Tfh细胞中的Bcl6蛋白表达水平是相当的（图2G、H）。同时，在CD62L⁺ Tfh细胞和PD-1⁺ Tfh细胞之间，Bcl6基因座的总染色质可及性没有显著差异（图2I）。综上所述，可以将在scRNA-seq中发现的CD62L⁺ Tfh细胞确定为真正的Tfh细胞。

三、CD62+ Tfh细胞不是来源于表达IL-21的PD-1+ Tfh细胞

为了分析CD62L⁺ Tfh细胞是否随着细胞分裂而发育，作者将来自Bcl6^RFP×Foxp3^GFP×OT-II小鼠中CFSE标记的naïve OT-II T细胞转移到CD45.1转基因小鼠中，并用OVA蛋白进行免疫。结果显示，在OVA免疫后细胞分裂三次以上可检测到CD45.2⁺CD44^hiCXCR5⁺Bcl6⁺ Tfh细胞，进而可检测其表面PD-1和CD62L的表达。可以观察到Tfh细胞随着细胞分裂同时获得PD-1和CD62L表达（图3A、B），表明CD62L⁺和PD-1⁺ Tfh细胞在免疫反应的早期阶段同时产生。作者进一步探索CD62L⁺ Tfh细胞的发育轨迹，这群细胞是否来自PD-1⁺ Tfh细胞。在进一步的分析中，作者使用了一种新的IL21命运映射小鼠。首先，对KLH免疫后的IL21^VFP报告小鼠进行分析，作者证实了PD-1与IL-21在CXCR5⁺细胞中共表达（图3C、D）。随后，通过利用新的IL21^creRosa^YFP谱系追踪小鼠，作者发现在KLH免疫后的免疫收缩期（第21天），记忆CD62L⁺ Tfh细胞不表达IL-21（图3C、E），表明大多数记忆CD62L⁺ Tfh细胞不是来源于表达IL-21的PD-1⁺ Tfh细胞。同时，作者还观察到一部分CD62L⁺ Tfh细胞在早期即表达中等水平的IL-21，但在免疫收缩期没有检测到这些细胞（图3C），这表明它们寿命不长，可能不能作为Tfh的记忆前体细胞。另外，通过RNA速率分析，作者观察到从Sell^hi到Pdcd1^hi Tfh细胞的发育轨迹（图3F）。

为了更好地表征CD62L⁺ Tfh细胞，作者对KLH免疫后产生的PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh细胞进行了TCR克隆型分析，以naïve T细胞作为对照。结果显示，naïve T细胞和Tfh细胞的两个亚群之间的TCR克隆型是不同的（图3G）。值得注意的是，CD62L⁺和PD1⁺ Tfh细胞共享许多TCR序列，这表明PD1⁺和CD62L⁺细胞来源于相同的祖细胞（图3G）。这与OT-II T细胞获得的结果一致，均提示抗原特异性CD62L⁺和PD-1⁺ Tfh细胞的产生是一个随机过程。然而，仍然有一部分CD62L⁺ Tfh细胞携带独特的TCR（图3G），可能是这些CD62L⁺ Tfh细胞来源于预先存在的或旁观记忆T细胞。随后，作者进一步分析了PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh细胞之间共享的TCR β序列，结果发现某些TCR序列在两组细胞之间显示出不同的分布（图3H、I），这表明TCR信号可能影响PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh细胞的发育。

image.png

四、表达CD62L的Tfh细胞不优先与B细胞接触

Tfh细胞是一类专门协助B细胞分化发育的辅助T细胞，其对B细胞滤泡生发中心反应和高亲和力抗体的产生至关重要。因此，作者随后比较了表达PD-1和CD62L的Tfh细胞与B细胞的结合情况。对来自KLH免疫的Bcl6^RFP×Foxp3^GFP报告小鼠（图4A）中与B细胞结合的Tfh细胞进行分选，提示大多数B细胞结合的Tfh细胞是PD-1⁺，而几乎不表达CD62L（图4 B），表明CD62L⁺ Tfh细胞不优先与B细胞接触。然而，随后作者观察到表达PD-1和CD62L的Tfh细胞都需要B细胞的辅助而产生，因为在KLH免疫的B细胞缺陷型μMT小鼠中PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh细胞都不存在。这些结果表明，CD62L⁺ Tfh细胞虽然不优先与B细胞接触，但其发育依赖于B细胞。为了进一步表征CD62L⁺ Tfh细胞的细胞定位，作者进行了免疫荧光实验。通过免疫Bcl6-RFP报告小鼠，我们观察到与CD62^-Bcl6⁺ T细胞相比，GC区域内表达CD62L的Bcl6⁺ T细胞的比例显著降低（图4C、D），表明GC中大多数Bcl6⁺的CD4 T细胞很可能表达PD-1，而缺乏CD62L的表达。此外，作者对CD62L⁺BCL6-RFP⁺细胞总体分布的综合分析阐明了它们主要定位于PNA⁺B220^- GC区域，在PNA^-B220⁺滤泡套和T细胞区仅稀疏存在（图4E）。

image.png

五、CD62L+Tfh细胞表现出记忆细胞的特征

为了更好地分析CD62L⁺ Tfh细胞的特征，作者基于前述的scRNA-seq结果比较了Pdcd1^hi细胞簇（C1）和Sell^hi细胞簇（C3）的DEGs。结果表明，Sell^hi簇中特异性表达的基因与干细胞和细胞周期有关的途径相关性高（GO：0019827；GO：0035019），但与参与mTCRC1信号传导和糖酵解过程的基因相关性较低（图5A）。基因组富集分析（GSEA）也揭示了CD62L⁺ Tfh细胞在与Wnt、Notch和Hedgehog信号通路相关的基因集上显著富集，而PD-1⁺Tfh细胞在与细胞周期、凋亡和氧化磷酸化相关的基因集上显著富集（图5B）。

接下来作者进一步验证scRNA-seq的分析结果，作者比较了CD62L+和PD-1⁺ Tfh细胞的bulk RNA-seq数据，与scRNA-seq数据一致，与PD-1⁺ Tfh细胞相比，CD62L⁺ Tfh细胞表现出与抗凋亡和淋巴细胞迁移相关的基因表达增加，与细胞周期和Tfh效应功能相关的基因表达减少（图5D）。

为了了解PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh在表观遗传水平上是否不同，作者使用ATAC-seq进行染色质可及性分析。总的来说，CD62L⁺ Tfh细胞的总开放染色质区明显少于PD-1⁺ Tfh细胞。Pdcd1和Sell基因座分别表现在PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh细胞中的可及性增加。对PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh细胞中的开放染色质区域进一步分析，发现干细胞相关的基因结合基序与CD62L⁺ Tfh细胞的可及染色质区域密切相关（图5F）。相反，与T细胞效应功能相关的基因结合基序在PD-1⁺ Tfh细胞中富集（图5G）。

随后，作者验证了CD62L⁺ Tfh细胞的记忆和干细胞样特征，将来自OVA免疫的CD45.1小鼠的CD62L⁺和PD-1⁺ Tfh细胞过继转移至接受了naïve CD4⁺ T细胞的Bcl6^RFP×Foxp3^GFPOT-II转基因小鼠（图6A、B）。在无抗原刺激的情况下，PD-1⁺ Tfh细胞迅速凋亡，CD62L⁺ Tfh细胞则显示出较低的细胞死亡率（图6B），并随后迁移到外周淋巴器官中（图6C）。重要的是，在抗原再次攻击时（图6D），CD62L⁺ Tfh细胞与naïve Tcells（图6E）一样增殖，且增殖迅速。值得注意的是，与所有其他细胞类型相比，CD62L⁺ Tfh细胞可更有效地产生次级CXCR5+Bcl6⁺ Tfh，特别是PD-1⁺效应Tfh细胞（图6E、F）。作者还观察到，在接受CD62L⁺ Tfh细胞的小鼠中，GC B细胞反应、产生抗原特异性抗体更强烈（图6J-L）。这些观察结果表明，CD62L⁺ Tfh细胞在再次免疫反应中反应更快，并为B细胞提供更有效的帮助。

image.png

六、转录因子KLF2调控CD62L+Tfh细胞的发育

scRNA-seq数据显示，Il7r表达与Sell相关，但与Tfh细胞中Pdcd1表达无关（图1B）。ATAC-seq分析显示，Il7r基因座在CD62L⁺比在PD-1⁺ Tfh细胞中更容易接近，表明Il7r是信号传导、记忆T细胞产生和维持的重要调节因子，且可能有助于CD62L⁺ Tfh细胞的调节。因此，作者给转移了Bcl6^RFP×Foxp3^GFPOT-II转基因小鼠naïve CD4+ T细胞且被OVA免疫的CD45.1受体小鼠施用抗IL7R阻断抗体。结果显示在免疫反应的高峰和晚期，IL7R阻断增加了Tfh细胞中PD-1的表达，降低了CD62L的表达。该数据表明IL7R信号调节了CD62L⁺PD-1⁺ Tfh细胞的发育。

scRNA-seq数据同样显示，Klf2的表达被限制在Sell^hi Tfh细胞中（图1B）。为了进一步理解验证，作者利用KLF2GFP报告小鼠，发现KLH免疫后Tfh细胞中KLF2与CD62L明显共表达，但不与PD-1共表达（图7A、B）。随后，作者利用Bcl6^creERT2Klf2^flfl×OT-II小鼠，将其在接受他莫昔芬治疗后，特异性敲除Bcl6⁺ Tfh细胞中的Klf2。将来自Bcl6^creERT2Klf2^flfl×OTII小鼠的naïve OT-II细胞转移到CD45.1受体小鼠中，随后进行OVA免疫，并在免疫后的第3、5和7天将他莫昔芬或对照剂玉米油，通过腹膜内注射到受体小鼠中（图7C）。结果显示总CXCR5⁺Bcl6⁺ Tfh细胞百分比不受Klf2缺陷的影响（图7D），而PD-1⁺和CD62L⁺ Tfh细胞都发生了显著改变（图7E）。在KLF免疫的Bcl6^creERT2Klf2^flfl小鼠中也观察到类似的结果（图7F-H），Tfh细胞中Klf2的缺乏抑制了CD62L⁺ Tfh的发育，但不影响总的Tfh细胞群（图7G、H）。此外，作者观察到Klf2调节CD62L⁺ Tfh细胞的功能是剂量依赖性的，因为其在Bcl6^creERT2Klf2^fl/+小鼠中发挥最小的作用（图7H）。

此外，作者将来自Bcl6^creERT2Klf2^flflOT2转基因小鼠的naïve OT-II细胞转移到Tcrbd^-/-受体小鼠中，随后进行OVA免疫和他莫昔芬诱导的Klf2缺失处理（图7I）。在初次免疫后第21天进行OVA/IFA再免疫。结果显示在他莫昔芬处理的小鼠中，CXCR5⁺Bcl6⁺ Tfh细胞比对照小鼠显著减少（图7J、K），特别是PD-1^hi效应Tfh细胞（图7M）。还观察到Tfh细胞中Klf2的缺失导致二次免疫反应期间无功能PD-1^-CD62L^- Tfh细胞的积累（图7M），同时，GC B细胞反应降低、抗原特异性IgG产生也显著减少（图7L、N）。这些结果表明，表达Bcl6⁺Tfh细胞中Klf2的缺失抑制了记忆Tfh细胞的形成。

image.png

小结

本篇文章的故事线：Tfh细胞在GC反应的调节过程中占据了重要地位。然而，Tfh细胞的不同亚群在表型和功能上并不完全一致。因此，本篇文章旨在揭示Tfh细胞的异质性，并为研究记忆Tfh细胞的发育和功能调节提供新的理论支持。

作者首先对在几种处理条件下产生的CXCR5⁺Bcl6⁺Tfh细胞进行了scRNA-seq，同时结合流式细胞术进行分析，结果显示除了已表征的PD-1^hi效应Tfh细胞亚群外，还存在一个CD62L⁺PD-1^low亚群。随后通过利用不同的小鼠模型，观察到CD62L⁺Tfh细胞百分比随免疫应答进展而增加；在作者构建的发育轨迹中，CD62⁺ Tfh细胞不是来源于表达IL-21的PD-1⁺ Tfh，且它们不优先与B细胞接触。基因富集分析及ATAC-seq分析显示CD62L⁺ Tfh细胞对细胞凋亡具有相对抗性，并且具有干细胞样表型，还可以有效地产生效应细胞来响应二次免疫反应。

最后，聚焦于转录因子对CD62L⁺ Tfh细胞的发育调控，在scRNA-seq分析的基础上，建立klf2缺陷的小鼠模型，证实了在CD62L⁺ Tfh细胞中特异性表达的Klf2是这些细胞产生发育过程中所必需的。

研究观点：此项研究基于对三种不同处理条件下产生的CXCR5⁺Bcl6⁺ Tfh细胞进行了scRNA-seq分析，揭示了CD62L⁺亚群的存在。随后，研究整体建立在逐步深入的生信数据分析结果之上，并开展相关动物实验进行验证。一方面为记忆Tfh细胞的发育及调控进行了验证，另一方面通过结合bulk RNA-seq、ATAC-seq分析，观察到CD62L⁺ Tfh细胞表达记忆和干细胞相关基因，且在再次免疫反应中也更容易产生效应细胞。总的来说，文章从CD62L⁺亚群的发生、发育及功能各个方面讲述了一个比较完整的故事。