在生命科学的精密调控网络中，原代纤毛不仅是细胞的“天线”，负责接收关键信号，其动态组装与解离的失衡更是多种发育障碍和疾病的根源。传统的遗传筛选多聚焦于“功能丧失”，但许多疾病，尤其是体细胞突变导致的疾病，往往由基因的“功能获得”或异常激活驱动。耶鲁大学分子、细胞及发育生物学系和Wu Tsai Institute（神经科学研究院）通过全基因组CRISPR激活（CRISPRa）文库筛选，成功鉴定出一条由F2R受体、SARM1水解酶、兰尼碱受体（RyR）、中心体周围钙信号及RhoA组成的纤毛拆解通路。更重要的是，该通路多个组分在局灶性皮质发育不良（FCD）患者中存在体细胞突变，为这类难治性癫痫相关疾病提供了全新致病机制和治疗方向。海星生物（HySigen）依托自主研发的CRISPRSeek™文库筛选平台，可提供CRISPR-KO、CRISPRa和CRISPRi（抑制）三大定制文库筛选服务，从sgRNA设计到数据深度分析全流程赋能，助力科研人员高效挖掘基因功能与疾病致病通路。
一、研究方法创新
本研究在方法学上的最大亮点在于，它摒弃了常规的CRISPR敲除筛选，转而采用 “功能获得” 的筛选策略。
1.细胞模型：以小鼠NIH-3T3成纤维细胞为主要筛选模型，构建融合CRISPRa过表达系统与Hedgehog（Hh）通路转录报告基因的稳定细胞系。该报告基因含Gli结合位点，可将纤毛依赖的Hh信号激活转化为杀稻瘟菌素抗性（BlastR）表达（图1A），实现纤毛功能的间接筛选。
2.CRISPRa文库筛选：采用Caprano CRISPRa sgRNA 文库，靶向> 22,000个小鼠基因，每基因设计6条sgRNA，通过dCas9-VP64介导基因转录激活。将文库导入报告细胞后，进行两轮“Hh信号激活+杀稻瘟菌素选择”，最后通过深度测序比较选择组与未选择组中sgRNA的丰度变化（图1C）。
筛选目标：通过CRISPRa文库过表达某个基因，如果该基因是纤毛信号或纤毛本身的负调控因子，则会导致纤毛丢失或Hh信号减弱，报告基因不表达，细胞在药物选择下被淘汰。反之，过表达正调控因子则会富集。
3.筛选结果验证：筛选成功复现了已知的Hh通路负向调控因子Gli3（被耗竭）和正向调控因子Gli1/2（被富集），证明了系统的有效性（图1D,E）。对一批新筛选出的候选基因（如F2R、SARM1）进行独立验证，均能重复出对Hh信号靶基因Gli1表达的影响（图1F）。
二、结果解读
1.从筛选到验证，锁定F2R与SARM1为纤毛解离诱导者
F2R（凝血酶受体）：构建了过表达F2R的CRISPRa细胞系。发现其过表达不仅抑制Hh信号（图1F），更直接导致纤毛数量显著减少（图2B, C）。这种表型可被F2R特异性抑制剂Vorapaxar完全挽救。通过使用强力霉素诱导系统进行时序控制，进一步证明F2R既能抑制纤毛新生，也能主动解离已形成的纤毛（图2G, H）。更重要的是，激活内源性F2R（使用其配体凝血酶）足以在野生型细胞中引发快速、可逆的纤毛解离（图2I, J）。
SARM1（一种NAD+水解酶）：同样，过表达SARM1也导致纤毛丢失（图2E, F），且此效应依赖于其NADase酶活性，可被特异性抑制剂DSRM-3716阻断。
结论：筛选出的两个明星基因F2R和SARM1被确定为有效的纤毛解离诱导因子。
图2.F2R或 SARM1的过度表达会导致纤毛的分解
2.通路解析——从膜受体到细胞骨架的级联反应
为了解析F2R 与 SARM1 调控纤毛拆解的下游分子通路及空间信号特征，研究者在F2R过表达诱导纤毛解离的模型中，加入SARM1抑制剂可以完全挽救纤毛表型（图3B）。同样，凝血酶激活内源性F2R引发的纤毛解离也能被SARM1抑制剂阻断（图3C）。这表明SARM1位于F2R下游，是执行解离命令的关键效应分子。
SARM1的酶活产物之一cADPR是已知的细胞内钙离子释放信使。研究推测并证实，cADPR通过激活兰尼碱受体（Ryanodine receptor, RyR)，导致内质网钙库释放。使用RyR抑制剂Dantrolene或钙螯合剂BAPTA-AM，均可有效阻断F2R或SARM1过表达引起的纤毛解离（图3D, E）。
钙信号下游，小G蛋白RhoA及其效应激酶ROCK被证实是该通路的终端。ROCK抑制剂Y-27632同样能挽救纤毛表型（图3D, E）。
研究利用靶向中心体的钙缓冲蛋白（PACT-Pvalb）证明，中心体周围的局部钙信号升高对于纤毛解离至关重要（图3F, G）。这解释了信号如何从质膜或细胞其他部位传递并精确作用于纤毛基底部。
结论：研究勾勒出一条清晰的纤毛解离通路：F2R激活 → SARM1介导的cADPR产生 → RyR通道开放 → 局部钙释放 → RhoA/ROCK激活 → 纤毛解离（图3A）。
3.生理相关性—该通路是内源性纤毛解离的通用开关
当用血清或溶血磷脂酸刺激静止期细胞，触发经典的纤毛解离时，SARM1、RyR或ROCK的抑制剂均能强力阻断这一过程，效果与已知的解离抑制剂细胞松弛素D相当（图4A, B）。这种解离作用独立于细胞周期进程，即使使用药物抑制细胞周期，F2R或血清依然能诱导纤毛解离。
抑制该通路不仅能阻止纤毛解离，还能在通常不利于纤毛形成的条件下（如高血清）促进纤毛形成和伸长（图4C, D）。
结论：该CRISPRa文库筛选出的通路，是细胞调控纤毛动态平衡的一个核心内源性机制，广泛参与多种生理性纤毛解离事件。
4.疾病关联—通路基因在局灶性皮质发育不良（FCD）中突变并致病
FCD是一种神经发育障碍，属于更广泛的皮层发育局灶畸形（FMCD）疾病类别，通常由体细胞突变引起，局部损害皮层神经元模式和功能，常导致难治性癫痫。
该纤毛解离通路中的多个组分（SARM1, RYR2, RYR3, RHOA），与最近在FCD患者中发现的体细胞突变基因存在高度显著的重叠（图5A）。研究者构建了患者来源突变体（SARM1-G528S、RhoA-P75S）的诱导型过表达细胞系，评估其对纤毛形成的影响：
SARM1-G528S：来自FCD患者的SARM1突变体，在诱导表达时比野生型SARM1引起更剧烈的纤毛丢失，表现出“功能获得”特性（图5B）。在培养的皮层神经元中，抑制SARM1能增加纤毛长度，表明SARM1在神经元中同样调控纤毛（图5C）。
RhoA-P75S：另一FCD患者来源的RhoA突变体，也能高效诱导纤毛解离（图5D）。更重要的是，在子宫内电转将该突变体导入小鼠皮层神经元前体细胞后，会导致神经元迁移缺陷和皮层分层异常，模拟了FCD的病理特征（图5E）。
连接mTORC1与纤毛解离：FCD另一常见致病机制是mTORC1信号通路过度激活。本研究发现，敲除Tsc2（导致mTORC1过度激活）同样会引起纤毛丢失，而这一表型可被SARM1抑制剂挽救（图5F）。这表明，mTORC1可能通过激活SARM1通路来促进纤毛解离。
结论：纤毛解离通路的异常激活，是FCD中多种遗传病变（直接突变于通路基因，或通过mTORC1间接激活）的一个共同下游效应。这提示FCD可能是一种由体细胞突变导致纤毛过早解离的“非经典纤毛病”。
三、研究意义与展望
该研究通过CRISPRa增益筛选，首次鉴定出一条保守的纤毛拆解通路（F2R→SARM1→cADPR→RyR→钙信号→RhoA），填补了纤毛动态调控的机制空白。更重要的是，该通路与FCD等神经发育疾病的关联，揭示了“异常纤毛拆解”可能是这类体细胞突变驱动疾病的共同病理特征，为FCD提供了全新治疗靶点——SARM1抑制剂有望通过恢复纤毛稳态改善皮层发育异常。
研究同时证实，CRISPRa筛选是挖掘增益功能基因与疾病致病通路的强大工具，尤其适用于解析体细胞突变相关疾病的分子机制。与传统CRISPR-KO筛选互补，CRISPRa可有效鉴定负调控因子，为功能基因组学研究提供更全面的视角。
海星生物（HySigen）不仅提供人/小鼠全基因组的激活文库和膜蛋白激活文库现货，还配备自主研发的CRISPRSeek™文库筛选平台与算法平台，提供CRISPR-KO、CRISPRa（激活）和CRISPRi（抑制）三大定制文库筛选服务，技术流程覆盖sgRNA设计、病毒包装、细胞转染、高通量测序及数据深度分析全流程，助力基因功能研究与药物靶点筛选。我们以高效、精准、智能的技术平台，满足多样化科研需求，无论是纤毛生物学、神经发育疾病、肿瘤免疫等基础研究，还是药物靶点发现、致病通路解析等转化研究，都能为科研人员提供一站式解决方案，加速科研成果落地。
参考文献：Elliott S D, Ready P J, Wrinn C M, et al. A CRISPR activation screen reveals a cilia disassembly pathway mutated in focal cortical dysplasia[J]. Science Advances, 2025, 11(44): eaeb7238.
技术服务：CRISPR/Cas9细胞基因编辑、CRISPR文库筛选/文库病毒/载体构建、分子诊断参考品/突变基因参考品/融合基因参考品、细胞稳转 / 细胞干扰
细胞试剂：HyCyte®干细胞/原代细胞/细胞株、三系诱导培养试剂、细胞专用培养基、基因编辑试剂盒、病毒现货、预筛选胎牛血清
