问题1.因为WGBS测序的原理是亚硫酸盐处理会使未甲基化的胞嘧啶（C）被转化为脱氨基胞嘧啶（T），而甲基化的胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）不受影响。然后通过分析测序reads覆盖的某个位点C/(C+T)百分比，完成该位点甲基化定量。但是如果某个位点本身是杂合状态，该位点存在CT变异，会对定量结果产生影响。所以严格来说应该过滤这些位点。
问题2.鉴于测序深度有限，并不能保证每个样本所有甲基化位点应测尽测，但是保留所有样本共有甲基化位点分析，会忽略掉一些处理过程中新出现的位点；所以可以根据每个处理的三个生物学重复，甲基化位点检出情况进行保留，一个甲基化位点在三个生物学重复中，在两个以上生物学重复中有出现，则保留该位点，用于后续差异甲基化分析。
针对问题可以采取两个策略结合尽可能过滤假阳性位点：
1.在进行甲基化定量之前，只取最优比对，且Q20过滤比对结果；定量时再次兼顾Q20和去除PCR重复影响。
samtools view -h -q 10 -F 4 -F 256 PEG_3d-3_pe.sorted.bam|grep -v XA:Z|grep -v SA:Z|samtools view -b - > PEG_3d-3.sort.Q10.unique.bam
BatMeth2 calmeth -Q 20 --remove_dup --coverage 4 -nC 1 --Regions 600 --step 50000 --genome /public/home/agis_kongweilong/Project/053dGenomes/MetDataAnalysis/01build_indexforBatMeth2/TGY/TGY.fa --binput PEG_3d_1.sort.Q10.unique.bam --methratio PEG_3d_1
2.通过空白样本的深度重测序，提取全基因组甲基化位点，用于过滤具有C/T转化的甲基化位点，避免基因组杂合位点对甲基化定量的影响。
