01文章信息

发表杂志名称：ADVANCED SCIENCE

中文标题：PLAUR + 中性粒细胞通过塑造免疫抑制微环境驱动肝细胞癌患者对 PD-1 抑制剂治疗的耐药性

英文标题：PLAUR+ Neutrophils Drive Anti-PD-1 Therapy Resistance in Patients with Hepatocellular Carcinoma by Shaping an Immunosuppressive Microenvironment

影响因子：14.1

发表日期： 2025 年 7 月 7 日

01研究概述

肝细胞癌（HCC）具有免疫抑制性肿瘤微环境（TME），限制了免疫检查点抑制剂的疗效。本研究发现，尿激酶型纤溶酶原激活物受体（PLAUR）阳性中性粒细胞在免疫治疗无应答者中富集，且与不良预后相关。通过多组学分析，PLAUR + 中性粒细胞被确定为通过塑造免疫抑制性 TME 介导免疫治疗耐药的关键驱动因素，其机制为通过 CD8+T 细胞排斥和巨噬细胞依赖的免疫抑制导致肿瘤免疫逃逸。研究通过基于结构的虚拟筛选发现一种新型 PLAUR 抑制剂，可逆转中性粒细胞的免疫抑制表型，在多种体内肿瘤模型中抑制肿瘤生长并增强抗 PD-1 治疗的疗效。这些结果表明，PLAUR + 中性粒细胞是免疫治疗耐药的关键调控因子，靶向 PLAUR 是提高 HCC 患者抗 PD-1 治疗疗效的潜在策略。

01研究结果

Figure 1：PLAUR + 中性粒细胞与抗 PD-1 治疗耐药及 HCC 患者不良预后相关

作者结合两个公共单细胞 RNA 测序数据集（PRJCA020880 和 GSE202642）进行生物信息学分析，通过 UMAP 降维、CNV 分析和典型标记基因检测，获得包括中性粒细胞在内的 8 种细胞群（图 1A）。聚类分析显示这些细胞群转录谱存在显著差异，提取的 353 个中性粒细胞特征标记基因经 GO 和 KEGG 分析，证实主要参与中性粒细胞迁移、吞噬体和内吞作用。作者鉴定出 55 个与抗 PD-1 治疗耐药相关的中性粒细胞特异性基因，经 LASSO 分析确定 6 个候选基因，其中 PLAUR 因在中性粒细胞中高表达且在耐药肿瘤中显著上调被选中（图 1B、C、D）。空间转录组分析显示免疫治疗耐药的 HCC 患者中 PLAUR + 中性粒细胞浸润度高；对 42 例接受抗 PD-1 治疗的 HCC 患者（队列 1）肿瘤组织进行免疫荧光染色，发现 PLAUR + 中性粒细胞主要存在于无应答者中（图 1E）。对 TCGA-LIHC 队列分析显示，肿瘤与癌旁组织 PLAUR 表达无显著差异，但 PLAUR 高表达患者肿瘤分化差、总生存期（OS）更短；对 180 例 HCC 患者（队列 2）分析得到一致结果，且基于 CD66b 和 PLAUR 的分层显示，PLAUR 和 CD66b 均低表达的肿瘤患者 OS 最佳，中性粒细胞高浸润患者 OS 更差（图 1F、G、H）。该图表明 PLAUR + 中性粒细胞与抗 PD-1 治疗耐药相关，且其存在预示 HCC 患者预后不良。

Figure 2：瘤内中性粒细胞降低抗 PD-1 治疗疗效并抑制 CD8+T 细胞浸润

作者构建中性粒细胞特异性 mRNA-LNPs 疫苗平台（SA-LNP），动态光散射分析显示添加唾液酸不显著改变其大小和 zeta 电位，琼脂糖凝胶实验证实 SA-LNP 可几乎完全包裹荧光素酶 mRNA（图 2A）。成像和定量分析显示，SA-LNP 在荷瘤小鼠肝脏中荧光素酶蛋白表达效率更高（图 2B）；通过 Cy5 标记胆固醇的 SA-LNP 在荷瘤 C57BL/6 小鼠体内的生物分布显示，SA-LNP 在肝肿瘤中显著积累，对肝中性粒细胞的选择性优于普通 LNPs，免疫荧光染色进一步验证（图 2C、D）。作者利用 SA-LNP 疫苗平台建立表达 PLAUR 的原位 HCC 小鼠模型，经抗 PD-1 单抗或 IgG2a 处理后，PLAUR 过表达中性粒细胞组小鼠肿瘤更大，对抗 PD-1 单抗耐药（图 2E、F、G）；免疫荧光染色和流式细胞术分析显示该组 T 细胞浸润显著减少（图 2H、I）。该图表明瘤内中性粒细胞会降低抗 PD-1 治疗的疗效，并抑制 CD8+T 细胞的浸润。

Figure 3：瘤内 PLAUR + 中性粒细胞与 HCC 免疫耗竭景观相关

作者通过 CyTOF 分析高、低中性粒细胞浸润的 HCC 肿瘤中免疫细胞浸润和功能状态，对 8 个 HCC 肿瘤的 CD45 + 细胞聚类得到 27 个细胞簇，注释为 10 种细胞类型（图 3A、B）。分析发现高瘤内中性粒细胞水平的 HCC 肿瘤中巨噬细胞浸润显著增加，CD8+T 细胞浸润减少（图 3C、D）；进一步分析显示，高中性粒细胞浸润肿瘤中的巨噬细胞具有免疫抑制特征，中性粒细胞的 LAG3、CTLA4 和 CD206 表达水平升高（图 3E、F、G、H）。对 TCGA-LIHC 队列的 ssGSEA 聚类分析显示，PLAUR 高表达肿瘤具有明显的免疫抑制表型；CIBERSORT 分析显示瘤内 PLAUR 水平与 M2 型巨噬细胞浸润呈正相关。该图表明中性粒细胞呈现免疫抑制状态，可能通过调控巨噬细胞和 T 细胞浸润，导致 HCC 微环境中的免疫耗竭。

Figure 4：PLAUR + 中性粒细胞呈现免疫抑制表型，通过影响巨噬细胞和 CD8+T 细胞重塑免疫微环境

作者利用单细胞 RNA 测序数据集分析 PLAUR + 与 PLAUR - 中性粒细胞的差异，GO 分析显示 PLAUR + 中性粒细胞主要参与免疫应答调控信号通路等，KEGG 分析显示驱动 N2 极化的 NF-κB/p65 信号通路显著激活（图 4A）。PLAUR + 中性粒细胞中 N2 极化相关基因（如 CD206、VEGFA 等）表达升高，而 T 细胞趋化和肿瘤杀伤相关基因表达显著降低。通过 CellChat 分析细胞间相互作用，发现 PLAUR + 中性粒细胞主要与巨噬细胞和内皮细胞通讯，与巨噬细胞的配体 - 受体相互作用更广泛，与 CD8+T 细胞的相互作用减弱（图 4B、C）。整合空间转录组与单细胞 RNA 测序数据发现，PLAUR + 中性粒细胞浸润分数高的区域，巨噬细胞浸润分数高而 T 细胞浸润分数低；人 HCC 组织多重免疫荧光染色证实，PLAUR + 中性粒细胞周围巨噬细胞浸润多、CD8+T 细胞浸润少（图 4D、E）。通过抗 CD8 中和抗体耗竭 CD8+T 细胞，发现其显著消除 PLAUR 敲低中性粒细胞的抗肿瘤作用，但不改变巨噬细胞浸润；利用 Clophosome 耗竭巨噬细胞，发现其减弱了中性粒细胞对肿瘤生长和 T 细胞浸润的影响，表明巨噬细胞在中性粒细胞调控 T 细胞中起关键作用（图 4F、G、H、I）。CellChat 分析显示 PLAUR + 中性粒细胞与巨噬细胞间存在显著配体 - 受体对，其中 CCL2-CCR2 是最可能的特异性配对；CCR2 拮抗剂（RS102895）可减弱 PLAUR + 中性粒细胞的促肿瘤作用，增加 M1 样巨噬细胞和 CD8+T 细胞在肿瘤内的积累。队列 2 的 IHC 染色显示 PLAUR 高表达肿瘤中 CD68 表达升高、CD8 表达降低，预后分析显示 PLAURlow/CD8high 和 PLAURlow/CD68low 患者 OS 最长。该图表明 PLAUR + 中性粒细胞呈现免疫抑制表型，通过调控巨噬细胞和 CD8+T 细胞重塑肿瘤免疫微环境，导致 HCC 患者预后不良。

Figure 5：PLAUR 抑制剂可逆转中性粒细胞的免疫抑制表型并抑制肿瘤进展

作者通过基于结构的高通量虚拟筛选 25361 种化合物寻找潜在 PLAUR 抑制剂，经 SPR 分析 40 种高排名化合物，发现 D-Ala-peptide T-amide（DAPTA）与 PLAUR 蛋白结合亲和力最高，在 Glu33、Glu44 等位点形成氢键（图 5A、B、C）。DAPTA 在中性粒细胞中的半数抑制浓度（IC50）为 29.03 μm（图 5D）；Western blot 显示 DAPTA 显著降低 PLAUR 蛋白水平，抑制 NF-κB/p65 信号通路激活；qPCR 和流式细胞术显示 DAPTA 处理显著抑制中性粒细胞中免疫抑制基因的表达，逆转其免疫抑制表型（图 5E、F、G）。质谱分析发现肌球蛋白重链 9（MYH9）是潜在的 PLAUR 相互作用蛋白，可激活 NF-κB/p65 通路；免疫共沉淀证实二者相互作用，DAPTA 处理降低 MYH9 蛋白表达，MYH9 抑制剂 Blebbistatin 可消除 PLAUR 对 NF-κB/p65 通路及 VEGFA、CXCL8 转录的影响。作者构建自发性 HCC 小鼠模型，发现 DAPTA 处理显著抑制肿瘤生长，在原位 HCC 模型中得到验证（图 5H、I、J、K）；免疫荧光和流式细胞术显示 DAPTA 处理减少肿瘤中 CD206 + 中性粒细胞和巨噬细胞浸润，增加 CD8+T 细胞浸润，但在免疫缺陷小鼠模型中无此作用，表明其抗肿瘤作用依赖免疫系统（图 5L、M、N）。该图表明 DAPTA 作为 PLAUR 靶向化合物，可有效逆转中性粒细胞的免疫抑制表型，发挥免疫依赖的抗肿瘤作用。

Figure 6：PLAUR 抑制剂增强 HCC 临床前模型中抗 PD-1 抗体的疗效

作者建立原位 HCC 小鼠模型，分别用 IgG、抗 PD-1 抗体、DAPTA 及抗 PD-1 抗体联合 DAPTA 处理（图 6A）。实验终点发现，抗 PD-1 抗体联合 DAPTA 处理比对照组或单药处理更能抑制肿瘤生长（图 6B、C）。免疫荧光染色和流式细胞术分析显示，联合治疗诱导显著免疫应答，增加 CD8+T 细胞浸润，减少肿瘤中中性粒细胞和巨噬细胞浸润（图 6D、E、F）。实验终点未观察到单药或联合治疗对肝、肾功能有显著毒性（图 6G）。该图表明 DAPTA 抑制 PLAUR 可增强 HCC 中抗 PD-1 治疗的疗效。

本研究揭示了 PLAUR + 中性粒细胞在肝细胞癌（HCC）抗 PD-1 治疗耐药中的关键作用：通过多组学分析发现 PLAUR + 中性粒细胞在免疫治疗无应答者中富集，与不良预后相关，其通过塑造免疫抑制性肿瘤微环境（如 CD8+T 细胞排斥、巨噬细胞依赖的免疫抑制）介导耐药；机制上，PLAUR + 中性粒细胞通过 NF-κB/p65 信号通路驱动 N2 极化，经 CCL2-CCR2 轴招募 M2 型巨噬细胞，进一步抑制抗肿瘤免疫。研究筛选出的新型 PLAUR 抑制剂 DAPTA 可逆转中性粒细胞的免疫抑制表型，在体内模型中抑制肿瘤生长，并与抗 PD-1 治疗协同增强疗效。综上，PLAUR + 中性粒细胞是 HCC 免疫治疗耐药的重要调控因子，靶向 PLAUR 为改善抗 PD-1 治疗效果提供了新的治疗策略。